一种组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种组织特异性细胞外基质材料及其制备方法以及在保护半月板损伤后的关节损伤和退化中的应用。本发明专利技术通过对猪半月板的内侧1/3部分进行脱细胞化制备mECM，该制备方法能够彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，有利于维持细胞稳态；该方法所制备的mECM材料兼具了优异的力学性能和生物相容性，不仅能够修复半月板损伤，还能够有效地减少损伤部位纤维化，该mECM可作为支架材料与骨髓间充质干细胞复合，起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用，这对组织再生和患者后期生活质量方面具有重大意义。期生活质量方面具有重大意义。期生活质量方面具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法以及在保护半月板损伤后的关节损伤和退化中的应用。

技术介绍

[0002]半月板是膝关节内位于股骨髁与胫骨平台之间的由弹性软骨构成的C形组织，其主要作用是缓冲运动过程中胫骨与股骨之间的机械压力，避免直接的机械冲击给关节软骨造成损伤。随着户外活动的增加，半月板损伤的发病率日益升高。半月板损伤后其对关节的保护功能减弱，因此常常并发膝部软组织的损伤，如交叉韧带损伤、关节囊损伤和软骨面损伤等，表现出膝关节有剧痛，不能自动伸直，关节肿胀等临床症状。
[0003]目前半月板损伤的临床治疗方式多采用半月板缝合，Henning对这种治疗方式进行关节镜随访评估,结果显示有约40%的病例出现不愈合或者不完全愈合的情况。半月板部分切除术是临床上治疗半月板损伤的另一种重要方式，但半月板行部分切除术后常常出现关节软骨退变，最终导致骨关节炎。可见，目前临床上针对半月板损伤的治疗缺乏理想的方法。
[0004]随着组织工程的发展，为半月板损伤修复带来了新的希望，为半月板修复提供一种新的治疗模式。三维支架材料，作为组织工程的重要组成部分，得到了广泛的重视。由于半月板缓冲运动过程中的机械应力需要非常强的机械强度，传统天然材料难以达到这一条件，因此，目前用于半月板组织工程修复的支架材料主要采用人工合成材料，而人工合成材料的生物相容性较差，这大大限制了它们在半月板修复中的应用。更重要的是，目前的支架材料和半月板修复策略忽略了对关节整体功能的保护，尤其是对关节软骨退化的限制，而这对组织再生和患者后期生活质量是极其重要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于针对现有技术中的不足，而提供一种兼具半月板力学性能和生物相容性的组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法，所制备的半月板细胞外基质材料能够起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种半月板细胞外基质材料在制备用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料中的应用。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供一种组织特异性半月板细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：（1）于屠宰场获得月龄6-7个月猪新鲜的半月板，洗净后取内侧1/3部分，小心分割成大小为5-10 mm3的组织小块；（2）将组织小块置于在浓度为0.02mol/L的醋酸溶液中，4℃环境下浸泡48小时；（3）将组织小块置于-80℃下冻干24小时，然后在室温4小时复温，得到冻干的组织，然后重复以上步骤，制备三个冻干的组织；
（4）将冻干的组织研磨成粉，置于2%SDS与10mmol/L的tris混合体系中，在25℃下搅拌24小时，弃上清液，进行三次循环，得到沉淀；（5）将沉淀置于0.1％过氧乙酸处理2小时，再次离心弃上清液后，用无菌水和带抑肽酶的PBS依次搅拌、洗涤、沉淀12小时；（6）将沉淀置于PBS中，用2mol/L的NaOH将溶液pH值调至8～8.5，4℃下搅拌6小时，然后用2 mol/L的HCl将溶液的pH值调至2～2.5；（7）将调pH后的溶液经冷冻离心机离心，去上清液；（8）将沉淀装入透析袋（分子量8000-14000）于蒸馏水中透析，每天换水并低温振荡，直至pH接近中性，然后电导在30μs以下，冷冻离心机离心,收集沉淀，倒去废液；（9）将沉淀溶解于PBS中，用200U/mL的DNA酶和50U/mL的RNA酶溶液在37℃下处理24小时以去除半月板细胞外基质中的核酸，然后PBS反复洗涤；（10）将洗涤后的溶液经冷冻离心机离心后收集沉淀，所得到的沉淀即为半月板细胞外基质材料，将其冻干后保存于-20℃备用。
[0008]优选的，步骤（1）中，所述半月板需在屠杀后12小时内获取。
[0009]优选的，步骤（7）中，离心条件为4℃，9000rpm，45min。
[0010]优选的，步骤（8）中，离心条件为4℃，9000rpm，40min。
[0011]优选的，步骤（10）中，离心条件为4℃，9000rpm，45min。
[0012]本专利技术还提供一种组织特异性半月板细胞外基质材料，所述半月板细胞外基质材料是采用上述制备方法制成的。
[0013]半月板是一种非常致密的结缔组织，常规的脱细胞外基质的方法很难实现彻底的脱细胞化，本专利技术采用的半月板脱细胞外基质的方法可以彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白（Collagen）、羟脯氨酸（hydroxyproline，OHP）和糖胺多糖（GAGs），有利于维持细胞稳态。
[0014]本专利技术还提供上述半月板细胞外基质材料在制备用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料，所述复合材料是由上述半月板细胞外基质材料与骨髓间充质干细胞复合而成。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术从仿生学原理得到启发，采用独创的半月板脱细胞外基质的方法，该制备方法相比常规的脱细胞外基质的方法可以彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖，从而有利于维持细胞稳态；通过实验证明，采用该方法制备的半月板细胞外基质（mECM）材料，兼具了优异的力学性能和生物相容性，不仅能够修复半月板损伤，还能够有效地减少损伤部位纤维化。因而，该mECM可作为支架材料，与骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合，起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用，这对组织再生和患者后期生活质量方面具有重大意义。
附图说明
[0017]图1为实施例1的mECM脱细胞化的实验效果图。
[0018]图2为实施例2的mECM促进BMSCs向纤维软骨分化能力的实验效果图。
[0019]图3为实施例3的大鼠背部mECM促进BMSCs向软骨分化能力的实验效果图。
[0020]图4为实施例4的mECM保护半月板损伤后的关节退化的实验效果图。
[0021]图5为实施例4的mECM保护半月板损伤后的骨关节炎的实验效果图。
具体实施方式
[0022]下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0023]实施例1. 制备mECM。
[0024]1、通过对新鲜的猪半月板的内侧1/3部分进行脱细胞化制备mECM，具体方法如下：（1）于屠宰场获得月龄6-7个月猪新鲜的半月板（在屠杀后12小时内获取），洗净后取内侧1/3部分，小心分割成大小为5-10 mm3的组织小块；（2）将组织小块置于在浓度为0.02mol/L的醋酸溶液中，4℃环境下浸泡48小时；（3）将组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组织特异性半月板细胞外基质材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）于屠宰场获得月龄6-7个月猪新鲜的半月板，洗净后取内侧1/3部分，小心分割成大小为5-10 mm3的组织小块；（2）将组织小块置于在浓度为0.02mol/L的醋酸溶液中，4℃环境下浸泡48小时；（3）将组织小块置于-80℃下冻干24小时，然后在室温4小时复温，得到冻干的组织，然后重复以上步骤，制备三个冻干的组织；（4）将冻干的组织研磨成粉，置于2%SDS与10mmol/L的tris混合体系中，在25℃下搅拌24小时，弃上清液，进行三次循环，得到沉淀；（5）将沉淀置于0.1％过氧乙酸处理2小时，再次离心弃上清液后，用无菌水和带抑肽酶的PBS依次搅拌、洗涤、沉淀12小时；（6）将沉淀置于PBS中，用2mol/L的NaOH将溶液pH值调至8～8.5，4℃下搅拌6小时，然后用2 mol/L的HCl将溶液的pH值调至2～2.5；（7）将调pH后的溶液经冷冻离心机离心，去上清液；（8）将沉淀装入透析袋于蒸馏水中透析，每天换水并低温振荡，直至pH接近中性，然后电导在30μs以下，冷冻离心机离心,收集沉淀，倒去废液；（9）将沉淀溶解于PBS中，用200U/...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟刚，
申请(专利权)人：钟刚，
类型：发明
国别省市：