基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了基于CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用。一种阿尔茨海默病细胞模型，是将靶向ADAM10基因的crRNA、TracrRNA和Cas9蛋白组成的RNP复合物电转入SH

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及基于CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用，特别涉及在SH
‑
SY5Y细胞中使用CRISPR/Cas 9基因编辑技术敲除ADAM10基因建立针对神经元坏死的更全面的AD细胞模型。

技术介绍

[0002]目前全球范围内AD患病人数超过5000万人，其对人们的生活质量与健康产生了巨大的影响。由于AD患者在护理和管理上产生高昂的费用，它被评为最具有破坏性的疾病之一
[1
‑
3]。尽管科学家们对该病进行了几十年的研究和药物开发工作，目前为止仍没有一种药物可以减缓AD的进展
[4]。
[0003]AD是一种具有复杂病理生物学特性的遗传异质性疾病。Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积如今仍然是诊断AD的主要神经病理学标准
[4
‑
7]。且在临床上许多针对降低Aβ的抗AD候选化合物未能实质性的改变AD患者的临床症状。研究者们对正常衰老死亡的老年人与老年AD患者进行尸检发现，脑内均有老年斑的形成。这些证据表明，去除斑块不足以改善脑功能受损和增强认知记忆功能，也不足以减慢AD进展或治愈AD。即淀粉样蛋白斑块已从患者的大脑中去除，依然存在AD的症状
[6]。AD患者的病症不仅是脑内存在斑块，亦有神经缠结以及大量的神经元坏死
[1,7,8]。
[0004]大部分AD转基因动物模型主要是模拟Aβ和细胞内高磷酸化Tau蛋白的累积，其主要的局限性是无法准确的模拟AD患者脑内的神经元坏死。近百年来，临床前AD动物模型从未令人信服地证明了AD进程中的关键点，即从未直接聚焦于神经元本身
[1,9
‑
21]。使用最多的AD细胞模型为iPSC，但多功能干细胞的培养耗时久，导致培养的过程中污染几率增大，极大的减缓了大规模筛选抗AD候选化合物的进程
[22
‑
25]。
[0005]现阶段AD药物在临床试验中全军覆没式的失败提示我们，其可能与临床前AD模型不成熟、不够全面以及不能很好地模拟AD病人脑内病征有关。所以开发全面的、更准确的新型AD模型至关重要。因而临床前AD模型的成功建立有望成为研发AD新药以及探讨AD病理的前提。
[0006]CRISPR/CAS 9基因编辑技术几乎可以在任何类型细胞和生物体中完成基因组修饰
[26
‑
28]，其彻底改变了生物医学等多个学科领域。且实用性高、操作简单及编辑效率高。CRISPR/CAS 9基因编辑技术现已成为一个多功能平台，其不仅可以对单个基因进行编辑，还可执行多基因编辑操作。这个全新的生物学方法的发展更加有利于科学家研究基因功能以及构建临床前疾病模型。在建立疾病模型中，该技术在癌症领域应用最多
[29]，其在AD的研究中的应用尚不够广泛。
[0007]ADAM10基因(Genbank登录号为NC_000015.10)存在于脑组织中，其可编码α分泌酶，参与APP蛋白的生成。有研究表明，ADAM10的过表达可抑制Aβ蛋白的产生和聚集。但现阶段并未见ADAM10基因与神经元关系的相关报道。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNP复合物，其特征在于，包括靶向ADAM10基因的crRNA、TracrRNA和Cas9蛋白。2.根据权利要求1所述的RNP复合物，其特征在于，所述的靶向ADAM10基因的crRNA选自crRNA1、crRNA2或crRNA3中的任意一种或多种；所述的crRNA1序列如SEQ ID NO.1所示，所述的crRNA2序列如SEQ ID NO.2所示，所述的crRNA3序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的RNP复合物，其特征在于，所述的靶向ADAM10基因的crRNA选自crRNA1、crRNA2和crRNA3的组合。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的RNP复合物在构建ADAM10基因敲除的阿尔茨海默病细胞模型中的应用。5.权利要求1
‑
3中任一项所述的RNP复合物在构建模拟脑内神经元坏死细胞模型中的应用。6.一种构建阿尔茨海默病细胞模型的方法，其特征在于，包括将权利要求1
‑
3中任一项所述的RNP复合物按照CRISPR/Cas 9基因编辑技术方法，电转入SH
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广基，李昔诺，阿基业，朱哲英，徐进宜，孙渊，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：