用于改变基因序列的组合物及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于改变基因序列的组合物，及改变基因序列的方法，还提供了利用所述方法制得的基因序列改变了的细胞及所述细胞的用途。胞的用途。

【技术实现步骤摘要】
用于改变基因序列的组合物及方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域。具体地涉及一种用于改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的组合物，还涉及改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的方法，还提供了基因改变了的，特别是TCR与B2M两种基因改变了的细胞及其用途。

技术介绍

[0002]近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸内切酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。
[0003]CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的向导RNA(guide RNA，gRNA)引导定位到基因组的目标序列上，此目标序列必须与一个以NGG或NAG形式的PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列相邻。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于改变细胞中基因序列的组合物，包含靶向TCR基因的第一gRNA，靶向B2M基因的第二gRNA，以及具有靶向切割活性的核酸内切酶；所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％；所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自a.SEQ ID NO:1，b.SEQ ID NO:2，c.SEQ ID NO:3，d.SEQ ID NO:4，e.SEQ ID NO:5，f.SEQ ID NO:6，g.SEQ ID NO:7，h.SEQ ID NO:8，i.a-h中的任一项，在其5
’
端或3
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端任选地添加1～4个碱基；所述第二gRNA的引导序列选自j.SEQ ID NO:9，k.SEQ ID NO:10，l.SEQ ID NO:11，m.j-l中的任一项，在其5
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端或3
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端任选地添加1～4个碱基；优选地，所述第一gRNA的引导序列选自a.SEQ ID NO:1，b.SEQ ID NO:2，或a-b中的任一项，在其5
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端或3
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端任选地添加1～4个碱基；所述第二gRNA的引导选自序列j.SEQ ID NO:9，k.SEQ ID NO:10，或j-h中的任一项，在其5
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端或3
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端任选地添加1～4个碱基；优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一gRNA的引导序列为SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:1，其中在SEQ ID NO:1的5
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端或3
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端任选地添加1～4个碱基；所述第二gRNA的引导序列为SEQ ID NO:9，或SEQ ID NO:9，其中在SEQ ID NO:9的5
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端或3
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端任选地添加1～4个碱基，所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于75％。3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔
比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。4.如权利要求3所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。5.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是哺乳动物细胞，优选是灵长类动物细胞，更优选是人细胞。6.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是免疫效应细胞，优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。7.一种用于改变细胞中基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦娇，张震阳，马苗苗，王刚，孙宇，
申请(专利权)人：甘李药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：