一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用，所述方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向Fzd6基因的第4个外显子，在对应位置设计并合成sgRNA，然后将体外转录的sgRNA/Cas9一起显微注射入小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫中，获得F0代小鼠，然后通过PCR和测序鉴定阳性的小鼠，与野生型背景鼠回交后，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子小鼠，即所构建的Fzd6基因敲除小鼠，经测序发现其序列在目标位置发生5个碱基的缺失并导致移码突变，该模型小鼠可用于研究FZD6在所参与的癌症、神经发育、血液病及精神类疾病中的作用。用。

【技术实现步骤摘要】
mRNA；
[0010](4)将上述sgRNA和Cas9 mRNA一起显微注射到小鼠的受精卵中；
[0011](5)将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠中，出生的小鼠即F0代小鼠，通过PCR反应和Sanger测序确认是野生型小鼠或阳性杂合子小鼠；
[0012](6)取鉴定后的F0代野生型小鼠和阳性杂合子小鼠进行回交，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子个体，此即所构建的Fzd6基因敲除小鼠模型。
[0013]进一步地，(2)中构建sgRNA/Cas9表达载体，具体为：
[0014](1)对sgRNA序列设计特异性引物，包括sgRNA正向引物和sgRNA反向互补引物；
[0015](2)将设计好的sgRNA以梯度降温的方式退火成双链后与质粒连接、转化、涂板，然后置于37℃细菌培养箱中孵育过夜，第二天挑取单克隆并接种于LB培养液中，在37℃恒温摇床中培养过夜，之后收集菌液进行质粒提取，同时进行PCR鉴定阳性克隆。
[0016]进一步地，所述的sgRNA正向引物序列为SEQ ID NO.2，sgRNA反向互补引物序列为SEQ ID NO.3。
[0017]根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种Fzd6基因敲除小鼠模型所述小鼠模型由上述的方法构建而成。
[0018]根据本专利技术实施例的第三方面，提供Fzd6基因敲除小鼠模型的应用，所述模型可用于研究FZD6在其所参与的癌症、神经发育、血液病及精神类疾病中的作用。
[0019]根据本专利技术实施例的第四方面，提供构建Fzd6基因敲除小鼠模型的试剂盒，含有sgRNA，所述sgRNA序列为SEQ ID NO.1。
[0020]进一步地，还含有Cas9 mRNA。
[0021]根据以上技术方案，本专利技术的有益效果如下：本专利技术采用最新的基因编辑技术，靶向Fzd6基因的第四个外显子进行修饰，与常用的技术相比，本专利技术所采用的技术简单、高效、快捷、成本低，可导致Fzd6基因的碱基缺失和移码突变。同时，本专利技术所提供的小鼠模型为进一步开展FZD6在其所参与的癌症、神经发育、血液病及精神类疾病中作用的研究奠定了很好的基础。
附图说明
[0022]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
[0023]图1为本专利技术实施例中Fzd6基因敲除策略图。
[0024]图2为本专利技术实施例中PCR鉴定策略示意图。
[0025]图3为本专利技术实施例中Fzd6基因敲除小鼠敲除区域序列分析图。
具体实施方式
[0026]以下通过具体实施例并结合附图对本专利技术做进一步说明。
[0027]本专利技术实施例提供了一种基于最新的CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR
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associated nuclease 9)基因编辑技术敲除Fzd6基因的小鼠模型，该技术是继ZFN、TALENs等技术后的第三代基因编辑技术，所
述小鼠模型是敲除了Fzd6基因的小鼠，所述小鼠的品系是C57BL/6J，所述敲除基因的名称(NCBI号)为Fzd6(14368)，所选转录本(Ensembl号)为Fzd6
‑
202(ENSMUST00000179165.8)。
[0028]本专利技术实施例提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法，敲除策略如图1所示，包括以下步骤：
[0029]首先，确定待敲除基因的靶位点位于Fzd6基因的第四个外显子，然后设计序列特异的sgRNA以及对应的引物。所述的sgRNA序列为SEQ ID NO.1，所述的sgRNA正向引物序列为SEQ ID NO.2，sgRNA反向互补引物序列为SEQ ID NO.3。
[0030]名称序号序列sgRNASEQ ID NO.1CACCAAAATCCAATGTCTCTFzd6
‑
ko
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TF1SEQ ID NO.2TCTGTGAATGCAGCAAAGTCATGGFzd6
‑
ko
‑
TR1SEQ ID NO.3GTCTCTCTGGGTATCTGAATCGTC
[0031]然后，构建sgRNA/Cas9表达载体，将设计好的sgRNA以梯度降温的方式退火成双链后与质粒连接。以DH5α大肠杆菌为载体进行转化和LB平板涂板，将平板置于37℃细菌培养箱中孵育过夜。随后在无菌操作台挑取平板上的约10个单克隆，接种于LB培养液中，在37℃，160rpm恒温摇床中培养过夜。之后收集菌液进行质粒提取，同时进行PCR鉴定阳性克隆。
[0032]接着，将sgRNA/Cas9的表达载体线性化并纯化后作为模板，根据MEGAshortscript
TM
T7 Transcription Kit试剂盒体外合成sgRNA和Cas9mRNA。
[0033]随后，通过显微注射将上述转录好的sgRNA和Cas9 mRNA一起注射到小鼠受精卵中，并将其移植于假孕母鼠子宫中，出生的小鼠即F0代，然后通过PCR和测序进行基因型鉴定，步骤如下：
[0034]收集小鼠尾巴，使用动物组织DNA提取试剂盒进行DNA的抽提，然后使用上述引物进行PCR反应，根据图2所示的PCR鉴定策略示意图进行鉴定，反应体系如下：
[0035]成分体积(μl)2
×
Taq Master Mix，Dye Plus12.5上游引物Fzd6
‑
ko
‑
TF1(10pmol/μl)1下游引物Fzd6
‑
ko
‑
TR1(10pmol/μl)1DNA模板(≈100ng/μl)1ddH2O9.5
[0036]PCR的反应条件如下：
[0037][0038][0039]然后对PCR产物跑2％琼脂糖凝胶电泳，接着进行割胶回收，将其纯化后通过Sanger测序鉴定序列是否有缺失，测序引物序列为SEQ ID NO.3。
[0040]对上述经鉴定为阳性的F0代小鼠与野生型背景鼠进行回交，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子个体，此即所构建的Fzd6基因敲除小鼠模型。鉴定方法同上述PCR和测序方法。
[0041]如图3所示，Fzd6基因第三个外显子有5个碱基的缺失(序列为：ATGTC)，由此导致下游基因序列发生移码突变，表明成功获得Fzd6基因敲除小鼠，模型构建成功。
[0042]本专利技术所构建的小鼠模型可用于开展FZD6在其所参与的癌症、神经发育、血液病及精神类疾病中作用的研究。
[0043]本专利技术实施例还提供构建Fzd6基因敲除小鼠模型的试剂盒，含有sgRNA，所述sgRNA序列为SEQ ID NO.1。进一步地，还含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括：(1)确定小鼠待敲除基因的特异性靶位点，针对小鼠Fzd6基因的第四个外显子设计sgRNA序列，所述的特异性的sgRNA序列为SEQ ID NO.1；(2)使用所述的sgRNA构建sgRNA/Cas9表达载体；(3)将所述的sgRNA/Cas9表达载体线性化并纯化后，体外转录合成sgRNA和Cas9 mRNA；(4)将上述sgRNA和Cas9 mRNA一起显微注射到小鼠的受精卵中；(5)将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠中，出生的小鼠即F0代小鼠，通过PCR反应和Sanger测序确认是野生型小鼠或阳性杂合子小鼠；(6)取鉴定后的F0代野生型小鼠和阳性杂合子小鼠进行回交，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子个体，此即所构建的Fzd6基因敲除小鼠模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中构建sgRNA/Cas9表达载体，具体为：(1)对sgRNA序列设计特异性引物，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明定，韩海军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：