一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法和试剂盒技术

本公开提供了一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)任选的预扩增步骤：利用随机引物来预扩增待测样品中的核酸物质；(2)扩增步骤：利用保守引物对来扩增包含特异性区域的片段；(3)杂交步骤：使通过步骤(2)产生的扩增产物与基因芯片杂交；(4)检测步骤：基于所述扩增产物与基因芯片的杂交结果，检测HPV亚型。本公开还提供了一种同时对多种HPV亚型进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含基因芯片和如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法和试剂盒


[0001]本公开提供了一种HPV基因分型检测方法，以及HPV基因分型检测试剂盒。

技术介绍

[0002]宫颈癌是全球女性第二大恶性肿瘤。全世界每年约有53万新发病例，约有31.1万人死于宫颈癌，其中大部分发生在发展中国家。在我国，宫颈癌的发病率和死亡率仅次于乳腺癌，每年新发病例数约为13万例且逐年提升，死亡约为3万例。已有研究表明高危型人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)是宫颈癌发病的主要原因。目前，宫颈癌是唯一病因明确、可以预防的肿瘤疾病。
[0003]HPV的基因组为双链环状DNA分子，包含约7200
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8000个碱基对。根据基因序列功能，HPV基因组可分为3个区域，分别是长控制区(LCR)、早期转录区(E区)和晚期转录区(L区)。LCR区含有基因组的复制起点和表达所需的调控元件，参与调控病毒的转录与复制；E区包括E1
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E7，负责编码病毒相关蛋白；L区包括L1和L2，编码病毒的主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)，L1约占衣壳蛋白的80％，序列高度保守，L2含量较少，变异较多。HPV依据DNA的同源性进行分型，目前已经鉴定出的HPV亚型有200多种。HPV可感染多种组织和器官，已经鉴定出HPV亚型中约有40余种亚型可感染生殖道上皮粘膜，根据致病性不同，HPV可分为低危型和高危型。低危型如HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等；HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等为高危型大约有19种，其中HPV16和HPV18被认为致病性最强，是宫颈癌的主要致病亚型。
[0004]约80％的女性在一生中至少会感染一次HPV，低危型HPV主要导致湿疣类病变，而长期持续性感染高危HPV与宫颈癌变有着密切的关系。由于HPV可在体内潜伏10年甚至更长时间，且不出现任何临床症状，人们很容易忽略HPV检测，这就导致了宫颈癌前病变发展到宫颈癌的过程极为漫长。在临床上将HPV检测纳入常规筛查，通过早期筛查提高HPV早期检出率，可以提高宫颈癌前病变的治愈率，最终预防宫颈癌的发生，降低宫颈癌的发病率。因此，HPV检测及分型在宫颈癌筛查、早期预防、临床诊断及后期治疗等方面具有十分重要的价值。
[0005]目前HPV检测方法主要分为非分子水平检测方法和分子水平检测方法，非分子水平检测方法主要有：醋酸白试验、阴道镜检测、宫颈刮片细胞学检查、宫颈和宫颈管活组织检查，这些方法受取材、涂片制作、阅读技术影响，准确率低、假阳性高、重复性差、漏诊率可达30％。分子水平检测方法主要有斑点印迹法、分子导流杂交法、飞行时间质谱法、荧光原位杂交法、Southern杂交法、PCR和杂交捕获法等。斑点印迹法具有放射性，危害检测人员的身体健康。荧光原位杂交法操作流程复杂，对检测人员要求较高。传统PCR检测方法假阳性较高。杂交捕获法试剂盒虽然无需进行PCR即可区分高危型与低危型，但是无法判断具体基因型。Sanger终止法准确度高，但一次只能读取单个基因的序列，不具备高通量特性。
[0006]目前市面上的HPV检测产品种类多，大多采用PCR荧光或杂交与其他技术结合的方式，但不同技术间的结合还存在灵敏度、背景、效率的问题，难以对HPV进行准确分型。

技术实现思路

[0007]本公开可以提供一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)任选的预扩增步骤：利用随机引物来预扩增待测样品中的核酸物质；
[0009](2)扩增步骤：利用保守引物对来扩增包含特异性区域的片段；
[0010](3)杂交步骤：使通过步骤(2)产生的扩增产物与基因芯片杂交；
[0011](4)检测步骤：基于所述扩增产物与基因芯片的杂交结果，检测HPV亚型。
[0012]本公开还可以提供一种试剂盒，所述试剂盒包含基因芯片和如SEQ ID NO:1
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17所示的保守引物对。
[0013]本公开还可以提供一种如SEQ ID NO:1
‑
17所示的保守引物对。
附图说明
[0014]图1示出了根据本公开的HPV亚型检测方法的一种实施方式，其中Biotin表示生物素，PL1和PR1表示保守引物对，PL1
’
和PR1
’
表示PL1和PR1的反向互补序列，Tag表示基因芯片上的地址码区域，Tag
’
表示Tag的反向互补序列。过渡探针(即，桥接探针)一端能够与目标片段(即，扩增产物)杂交，另一端能够与基因芯片探针上的地址码区域杂交，从而实现目标片段与基因芯片通过过渡探针间接杂交。
具体实施方式
[0015]基因芯片技术采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地固定于硅片、玻璃片、塑料片或尼龙基底等固体支持物上，形成二维阵列，与待测的标记样品按碱基对配对原理进行杂交，从而检测特定序列信息。基因芯片技术已在病原体检测、疾病易感基因发现、疾病分子水平诊断、基因功能确认及多靶位同步超高通量药物筛选等医学与生物学领域得到广泛应用。
[0016]本公开的专利技术人创造性地想到了一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法，其中首先，任选地，利用随机引物来预扩增样品中的核酸物质，提高HPV核酸浓度；随后，利用针对不同亚型HPV的保守区域的序列而设计的保守引物对来扩增包含不同亚型HPV的特异性区域的片段；最后，使扩增产物与基因芯片直接杂交(基因芯片上的探针被设计为包含与所述特异性区域至少部分反向互补的序列)或间接杂交(例如，使用桥接探针，该桥接探针能够同时与基因芯片上的探针和所述特异性区域杂交)，利用芯片扫描仪和计算机对杂交信号进行检测和分析，从而达到检测目的。
[0017]现有技术中已知的利用PCR方法进行HPV分型依赖于扩增步骤中是否产生了相应的产物，即，扩增引物是针对不同亚型HPV的特异性区域的序列而设计的；因此，如果要同时检测多种HPV亚型，则需要许多引物(例如，检测33种亚型，将需要66种引物)，但引物太多将会互相影响扩增效率，从而进一步影响检测效率。与此相反，本公开的方法不是通过扩增步骤来实现特异性检测的，本公开的扩增引物是针对不同亚型HPV的保守区域的序列而设计的，也就是说，在扩增步骤中，各种亚型HPV都能产生相应的产物，HPV分型是通过后续的特异性杂交实现的。因此，可以使用尽可能少的引物来实现同时检测多种HPV亚型，从而避免了引物太多会互相影响扩增效率的问题。
[0018]通过使用本公开的HPV亚型检测方法，能够以更低的成本更加灵敏、精准、高效地
进行多种HPV的分型。
[0019]除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
[0020]在本文中使用时，“待测样品”指的是从生物体(例如，人)获得的细胞、组织、切除物、分泌物、血液等样品或从非本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时对多种HPV亚型进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)任选的预扩增步骤：利用随机引物来预扩增待测样品中的核酸物质；(2)扩增步骤：利用保守引物对来扩增包含特异性区域的片段；(3)杂交步骤：使通过步骤(2)产生的扩增产物与基因芯片杂交；(4)检测步骤：基于所述扩增产物与基因芯片的杂交结果，检测HPV亚型。2.如权利要求1所述的方法，其中所述保守引物对的序列如SEQ ID NO:1
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17所示。3.如权利要求2所述的方法，其中进行所述步骤(1)。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述多种HPV亚型为30种HPV亚型，所述30种HPV亚型由HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 66、HPV 68、HPV 73、HPV 82、HPV 6、HPV 11、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 54、HPV 61、HPV 67、HPV 70、HPV 72、HPV 81和HPV 83组成。5.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述多种HPV亚型为33种HPV亚型，所述33种HPV亚型由HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，何沛中，汪旭，许国强，
申请(专利权)人：生捷科技嘉兴有限公司，
类型：发明
国别省市：