针对D-二聚体的结合蛋白及其应用和检测D-二聚体的方法技术

本发明专利技术公开了一种针对D‑二聚体的结合蛋白及其应用和检测D‑二聚体的方法，涉及抗体技术领域，本发明专利技术公开的结合蛋白包括抗原结合结构域；抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个：G‑Y‑X1‑F‑T‑X2‑Y‑N‑X3‑H、Y‑I‑X1‑P‑Y‑X2‑G‑E‑T‑X3‑Y‑N‑Q和A‑R‑X1‑G‑X2‑Y‑X3‑P‑W‑F‑T；本发明专利技术提供的结合蛋白可特异性结合D‑二聚体，具有较好的结合活性和亲和力，有利于提高检测的特异性和灵敏度，可用于D‑二聚体的检测和D‑二聚体水平异常疾病的诊断，为D‑二聚体的检测提供多种蛋白选择，该结合蛋白也可用于制备血栓导向溶栓剂，为血栓的溶栓提供一种新的思路和选择。

【技术实现步骤摘要】
针对D-二聚体的结合蛋白及其应用和检测D-二聚体的方法
本专利技术涉及抗体
，具体而言，涉及一种针对D-二聚体的结合蛋白及其应用和检测D-二聚体的方法。
技术介绍
D-二聚体(DD)是血液中的纤维蛋白，经过活化和水解，产生的一种特异的，最简单的降解产物，是特异性的纤溶过程标记物。人体内的纤溶系统主要维持着血管壁的正常通透性、血液的流动状态和组织修复，在病理状态下机体发生凝血，凝血酶会作用于纤维蛋白转变为交联的纤维蛋白，交联纤维蛋白在溶解过程中，释放出X’、Y’、D’、E’等碎片，并形成DD、DD/E、YD/YD、YY/DD等复合物。这些碎片进一步降解为最小的片段DD和DD/E复合物，DD分子量约62000D，在体内半衰期>3h，主要经肾脏排泄。D-二聚体水平的升高反映了体内存在着凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物，代表血块在血管循环系统中形成，是急性血栓形成的一个敏感的标记物。心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等均可导致D-二聚体升高。1972年，Gaffney首先提出D-二聚体检测，可作为监测凝血性疾病的“有用的工具”。随后在1983年，Rylatt等提出基于单克隆抗体检测D-Dimer(乳胶凝集法)。近年来，应用单克隆抗体和蛋白质连接技术，科研工作者推出了血栓导向溶栓剂。基本原理是利用抗原〔D—二聚体〕和抗体〔抗D—二聚体单抗)之间的亲和力，将抗血栓特异性成分的单抗与溶栓药物相连接，形成抗体－溶栓剂复合体。其中的单抗如同导弹一样，可携带溶栓剂特异地与血栓结合，使得血栓部位的溶栓剂高度聚集，从而增强对血栓的溶解作用。后来又发现将抗D—二聚体单抗标记放射性核素，在抗体与抗原特异性结合过程中，可将放射性核素携带到血栓局部，再用放射性核素检测仪监测体内放射性核素的分布，从而达到利用导向示踪剂定位诊断血栓的目的。D-二聚体在临床上作为血栓性疾病溶栓治疗的特异性监测指标。因为纤溶蛋白降解产物中，唯有D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此，理论上，D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。在溶栓治疗中，D-二聚体含量变化一般有以下特点：①溶栓后D-二聚体含量在短期内明显上升，而后逐渐下降，提示治疗有效；②溶栓后D-二聚体含量持续升高或下降缓慢，提示溶栓药物用量不足；③溶栓治疗应持续到D-二聚体含量下降至正常范围。另外，溶栓治疗结束后，应定期观察一段时间的D-二聚体的变化以防血栓复发。据报道，肿瘤也会引起患者D-二聚体浓度升高，并且可以作为分期、预后等判断标准。MasatoshiOya等在一项研究中发现，结直肠癌患者的D-二聚体比良性疾病患者的明显要高，术前的D-二聚体与肿瘤的病理结果和分期正相关。术前D-二聚体水平高的患者的术后生存期明显要比低的患者短。对128例恶性肿瘤患者进行D-二聚体测定，结果发现：急性白血病组、恶性淋巴瘤组、实体瘤组初发组分别较对照组明显增高.有明显差异(P<0.05)，缓解期明显低于初发期(P<0.05)。研究表明，在肝脏疾病中，血浆D—二聚体的含量明显增高，且与肝病的严重程度呈正相关。Wilder等测定59例急性和慢性肝病思者血浆D—二聚体，其中48例有不同程度的升高。各型肝炎患者D二聚体水平明显高于对照组并且具有显著性差异(P<0.01)，患者D二聚体的水平依次为重型肝炎组>；肝硬化组>；慢性肝炎组中，重度组>；急肝组>；慢性肝炎组，这可能与抗凝系统受损有关。除此之外，文献也报道了D-二聚体在脑梗，心梗，肾病，新生儿窒息等多种疾病临床检测上的应用。目前临床上已经有许多单克隆抗体能够区分D—二聚体和单体的D，可以在纤维蛋白原存在的情况下，监测纤维蛋白降解产物。这些抗D—二聚体的抗体不仅可以检测游离的D—二聚体，而且可以检测大的纤维蛋白复合物中聚合的D域，包括在凝血过程早期形成的铰链的纤维蛋白复合体。对D—二聚体抗原的准确测定，可以早期发现血管内凝血。D-二聚体的检测方法有三P试验、胶乳凝集法(LATEX)、ELISA法、免疫渗滤胶体金显色反应法等，而临床最常用是：ELISA、LATEX和免疫过滤胶体金染色法，其中LATEX法测定速度快，但结果重复性差，敏感度不如ELISA法；ELISA法敏感度高，但检测时耗时较长。免疫过滤胶体金显色反应能定量检测，灵敏度高，结果与ELISA结果可媲美，但是特异性不强，受脂质颗粒干扰。目前用的这些检测方法都是建立在特异单抗的基础上的，也就是说针对D-二聚体的单抗制备成为提高检测灵敏度和特异性的关键。目前用于检测D-二聚体的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，因此，本领域针对检测D-二聚体的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种D-二聚体的结合蛋白及其应用和检测D-二聚体的方法。本专利技术提供的结合蛋白可以特异性结合D-二聚体，具有较好的结合活性和亲和力，有利于提高检测的特异性和灵敏度，可用于D-二聚体的检测和D-二聚体水平异常疾病的诊断，为D-二聚体的检测提供多种蛋白选择，该结合蛋白也可用于制备血栓导向溶栓剂，为血栓的溶栓提供一种新的思路和选择。名词定义术语“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。当在本文中使用时，“骨架区”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对D-二聚体的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性的相似互补决定区：/n互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-T-X2-Y-N-X3-H，其中：X1是T或S，X2是D或N，X3是L、V或I；/n互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为Y-I-X1-P-Y-X2-G-E-T-X3-Y-N-Q，其中：X1是Y或D，X2是L、V或I，X3是A或G；/n互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-R-X1-G-X2-Y-X3-P-W-F-T，其中：X1是S或T，X2是N或D，X3是N或D；/n互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为Q-S-X1-X2-N-S-G-X3-Q-K-X4-Y，其中：X1是I或L，X2是F、V或L，X3是S或T，X4是D或N；/n互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为X1-A-S-X2-R-X3-S，其中：X1是G、F或W，X2是S或T，X3是D或E；/n互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为X1-X2-D-Y-S-Y-P-X2-T，其中：X1是Q或K，X2是Q或N，X3是I、V或L。/n...

【技术特征摘要】
1.一种针对D-二聚体的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域；所述抗原结合结构域包括如下互补决定区中的至少一个，或者包括与下述至少一个互补决定区的序列具有至少80％的序列同一性的相似互补决定区：
互补决定区CDR-VH1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-T-X2-Y-N-X3-H，其中：X1是T或S，X2是D或N，X3是L、V或I；
互补决定区CDR-VH2，其氨基酸序列为Y-I-X1-P-Y-X2-G-E-T-X3-Y-N-Q，其中：X1是Y或D，X2是L、V或I，X3是A或G；
互补决定区CDR-VH3，其氨基酸序列为A-R-X1-G-X2-Y-X3-P-W-F-T，其中：X1是S或T，X2是N或D，X3是N或D；
互补决定区CDR-VL1，其氨基酸序列为Q-S-X1-X2-N-S-G-X3-Q-K-X4-Y，其中：X1是I或L，X2是F、V或L，X3是S或T，X4是D或N；
互补决定区CDR-VL2，其氨基酸序列为X1-A-S-X2-R-X3-S，其中：X1是G、F或W，X2是S或T，X3是D或E；
互补决定区CDR-VL3，其氨基酸序列为X1-X2-D-Y-S-Y-P-X2-T，其中：X1是Q或K，X2是Q或N，X3是I、V或L。


2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，
所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；
所述互补决定区CDR-VH2中，X1是Y；
所述互补决定区CDR-VH3中，X1是S；
所述互补决定区CDR-VL1中，X4是N；
所述互补决定区CDR-VL2中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是T；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X1是S；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是A；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X3是G；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X3是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是F；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X2是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是S；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是T；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是G；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是F；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X1是W；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X3是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X3是L；
优选的，所述抗原结合结构域与D-二聚体蛋白具有KD≤5.95×10-7mol/L的亲和力；
优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟媛，崔鹏，何志强，钟冬梅，叶颖，覃婷，
申请(专利权)人：东莞市朋志生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44