一种限制型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基因敲除小鼠的构建方法及其应用。该基因敲除小鼠的构建方法包括特异性敲除受体小鼠心肌细胞的Hgs基因，得到所述基因敲除小鼠。该基因敲除小鼠出现心肌纤维化、钙化、心肌细胞死亡及心脏舒张功能受损，其出现的病理改变与人类限制型心肌病类似。

【技术实现步骤摘要】
一种限制型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种限制型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用。
技术介绍
目前我国心血管病现患人数达2.9亿，心血管病死亡率占居民疾病死亡构成40％以上，高于肿瘤和其它疾病。心血管疾病已成为重大的公共卫生问题，加强心血管疾病的防治工作刻不容缓。心肌病是由各种病因引起的一组非均质的心肌病变，表现为心室不适当的肥厚或扩张。心肌病可以单纯局限于心脏(原发性心肌病)，也可以是全身系统性疾病的一部分(继发性心肌病)，最终导致心力衰竭或死亡。原发性心肌病主要包括肥厚型心肌病、扩张性心肌病、致心律失常性右室心肌病及限制性心肌病等几大类。在几类心肌病中，肥厚型心肌病是目前分子机制研究比较透彻疾病之一，多由多种编码心肌肌小节收缩蛋白基因突变导致；扩张型心肌病发生主要与编码细胞骨架基因的突变有关；致心律失常右室心肌病临床表现为右室心肌病变和室性心律失常，其发生多与编码心肌桥粒蛋白的基因突变有关。限制型心肌病(restrictivecardiomyopathy，RCM)主要表现为心室充盈受限，舒张期容积缩小，但心室收缩功能及室壁厚度基本正常，可出现间质的纤维增生。尽管限制型心肌病远较其他几类心肌病发病率低，但该病预后差且心源性猝死风险高。有研究显示，编码肌节相关基因的突变是RCM发生的重要原因，且已在心肌肌钙蛋白T(cardiactroponinT，TNNT2)，肌球蛋白调节轻链基因(myosinregulatorylightchain2，MYL2)和β-肌球蛋白重链基因(β-myosinheavychain，MYH7)等基因中找到与限制性心肌病相关的突变位点。但是，却仅有少量的疾病动物模型被建立用于RCM研究。通过在小鼠体内分别过表达携带在人RCM中发现的突变形式的cTnI(K178E和R192H)和突变形式的肌球蛋白轻链基因(ELCE143K)，都会导致RCM的发生。此外，在人RCM中发现了一种Myopalladin的无义突变形式(MYPNQ529x)，通过进一步构建这种突变形式的基因敲入小鼠，发现杂合性敲入小鼠MypnWT/Q526X也能很好的模拟RCM的表型。鉴于目前关于RCM发生的分子机制未完全明确，且缺少理想的RCM疾病动物模型，因此，寻找调控RCM发生的关键分子，建立RCM遗传修饰小鼠模型对于疾病的早期诊断和防治，以及发展个性化治疗策略具有重要和现实意义。
技术实现思路
本专利技术提供了基因敲除小鼠在制备限制型心肌病动物模型中的应用，所述基因敲除小鼠心肌细胞不表达Hgs基因及其编码蛋白。例如，该基因敲除小鼠通过将α-MHC-Cre转基因小鼠与Hgs条件基因打靶小鼠(Hgsf1/f1)交配得到。可选地，所述基因敲除小鼠的构建方法包括特异性敲除受体小鼠心肌细胞的Hgs基因，得到所述基因敲除小鼠。特异性基因敲除是指通过遗传手段使得动物发育的某一阶段或某一特定组织、器官、细胞中的特定基因不表达，而动物发育的其它阶段或其它组织、器官、细胞中的该基因表达正常。例如，心肌细胞特异性Hgs基因敲除可为仅实现心肌细胞中的Hgs基因及蛋白不表达，对其它细胞中Hgs基因表达没有影响。所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。可选地，所述特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因为敲除所述受体小鼠心肌细胞基因组中Hgs基因中的第五外显子。可选地，所述特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因包括采用Cre/loxP系统特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因。可选地，所述基因敲除小鼠的构建方法包括如下步骤：将Hgsf1/f1小鼠和α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠；所述Hgsf1/f1小鼠是将C57BL/6J小鼠的Hgs基因替换为Hgsf1等位基因，Hgsf1等位基因是将所述Hgs基因(GenBankAccessionNo.NC_000077(REGION：120358431-120374810，UpdateDate2020-09-22))的第843-9369位(即包含第二外显子至第八外显子之间的片段)替换为SEQIDNo.3所示的片段，保持所述Hgs基因的其它核苷酸序列不变得到的Hgs基因突变体；所述α-MHC-Cre小鼠为心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠；选择所述Fl代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Hgsf1/+小鼠，所述α-MHC-Cre；Hgsf1/+小鼠的一条染色体携带所述Hgs基因，另一条染色体携带所述Hgsf1等位基因，且所述α-MHC-Cre；Hgsf1/+小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶，例如，所述α-MHC-Cre；Hgsf1/+小鼠携带α-MHC基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA的α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列如SEQIDNo.1所示)；所述α-MHC-Cre；Hgsf1/+小鼠和所述Hgsf1/f1小鼠交配得到F2代小鼠；选择所述F2代小鼠中的双阳性纯合子小鼠，命名为α-MHC-Cre；Hgsf1/f1小鼠，所述α-MHC-Cre；Hgsf1/f1小鼠为所述基因敲除小鼠，所述α-MHC-Cre；Hgsf1/f1小鼠的两条染色体均携带所述Hgsf1等位基因，且所述α-MHC-Cre；Hgsf1/f1小鼠在心肌细胞特异性表达Cre重组酶。例如，所述α-MHC-Cre；Hgsf1/f1小鼠携带α-MHC基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA的α-MHC-Cre-hGH目的片段(序列如SEQIDNo.1所示)。可选地，所述α-MHC-Cre小鼠携带包括α-MHC基因启动子和Cre重组酶基因的目的片段，所述α-MHC基因启动子启动所述Cre重组酶基因的表达。例如，该目的片段包括α-MHC基因启动子、Cre重组酶基因和人生长素基因polyA，序列如SEQIDNo.1所示。采用PCR可对前述F1代小鼠或前述F2代小鼠进行基因型分析。以小鼠基因组DNA作为PCR反应的模板。用Cre引物1(5′-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3′)和引物2(5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′)扩增，Cre阳性小鼠可以扩增出629bp的片段。用Hgs引物3(5′-CCTGGTGTCCTTGGATCTCCT-3′)和引物4(5′-GAGCCACTCTTGTAGCCTTGC-3′)扩增，这对引物可以扩增出212bp(野生型条带)和311bp(f1条带)。从而区分出不同基因型的子代小鼠。前述基因敲除小鼠的构建方法也属于本专利技术的保护范围。该构建方法构建的基因敲除小鼠的应用也属于本专利技术的保护范围，该应用为在开发或筛选预防和/或治疗心肌病药物或在限制型心肌病研究中的应用。该心肌病具体可为限制型心肌病。本专利技术还提供了所述Hgs基因或所述Hgs基因编码的Hgs蛋白在制备限制型心肌病小鼠模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因敲除小鼠在制备限制型心肌病动物模型中的应用，其特征在于：所述基因敲除小鼠心肌细胞不表达Hgs基因及其编码蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.基因敲除小鼠在制备限制型心肌病动物模型中的应用，其特征在于：所述基因敲除小鼠心肌细胞不表达Hgs基因及其编码蛋白。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因敲除小鼠的构建方法包括特异性敲除受体小鼠心肌细胞的Hgs基因，得到所述基因敲除小鼠。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因为敲除所述受体小鼠心肌细胞基因组中Hgs基因中的第五外显子。


4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因包括采用Cre/loxP系统特异性敲除所述受体小鼠心肌细胞的Hgs基因。


5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述基因敲除小鼠的构建方法包括如下步骤：
将Hgsfl/fl小鼠和α-MHC-Cre小鼠交配得到F1代小鼠；
所述Hgsfl/fl小鼠是将C57BL/6J小鼠的Hgs基因替换为Hgsfl等位基因，Hgsfl等位基因是将所述Hgs基因的第843-9369位替换为SEQIDNo.3所示的片段，保持所述Hgs基因的其它核苷酸序列不变得到的Hgs基因突变体；
所述α-MHC-Cre小鼠为心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠；
选择所述Fl代小鼠中的双阳性杂合子小鼠，命名为α-MH...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓，李振华，王剑，王添乐，侯宁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11