脱细胞的肌肉基质制造技术

本文公开了肌肉植入物和制造包含一种或更多种脱细胞的肌肉基质的肌肉植入物的方法。肌肉基质可以以适于注射或植入的颗粒形式提供。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脱细胞的肌肉基质本申请根据35U.S.C.§119，要求于2019年5月30日提交的美国临时专利申请第62/854,647号和于2018年10月11日提交的美国临时专利申请第62/744,204号的权益。每项前述临时申请的全部内容通过引用并入本文。本公开内容总体上涉及制造脱细胞的肌肉基质和在腹壁和其他肌肉缺损的修复、再生和/或治疗中使用脱细胞的肌肉基质的方法。各种损伤、疾病和外科手术导致肌肉质量，特别是骨骼肌的损失。例如，手术去除软组织肉瘤和骨肉瘤可以导致大块肌肉的损失。其他手术和美容程序，诸如疝修复和肌肉增大，需要对肌肉含量进行长期管理。肌肉受损也可以由损伤引起，诸如由钝力创伤和枪伤引起。目前的肌肉再生程序集中于使用肌肉同种异体移植物(例如，从患者的供体部位或从尸体上收获臀大肌)或使用包含完全脱细胞的真皮和其他组织基质的异种移植物。然而，使用肌肉移植物可能导致过度的炎症(导致疤痕组织形成和潜在的排斥)，并且如果肌肉移植物是从患者收获的，则出现供体部位处肌肉损失的问题。因此，仍然需要用于肌肉修复和再生的长期管理的改进的方法和组合物，包括功能性肌肉块的产生。此外，仍然需要增加肌肉质量的方法，例如，以改进功能特征或美学(例如，对于具有低肌肉质量的个体或那些希望增加力量或质量的个体)。概述因此，本文公开了包含脱细胞的肌肉基质的肌肉植入物，以及它们用于改进肌肉修复、治疗、增强、增大和/或再生的用途，所述脱细胞的肌肉基质保留至少一些加工之前肌肉组织中通常存在的肌纤维或其他肌肉结构蛋白。在各种实施方案中，提供了制备肌肉植入物的方法。该方法可以包括提供至少一种肌肉样品；将至少一种肌肉样品与酶接触；将至少一种肌肉样品脱细胞以产生至少一种脱细胞的肌肉基质；以及控制酶的暴露持续时间和/或浓度和脱细胞过程，以保留脱细胞前肌肉样品中通常存在的至少一些肌纤维。还提供了提供改进的强度的片状组织产品。片状产品可以包括脱细胞的肌肉基质和脱细胞的真皮基质。基质可以层放(layer)以允许形成复合物。使用这种基质的方法可以允许治疗需要产生功能性肌肉的复杂损伤。真皮基质可在肌肉再生期间为承重提供结构支撑，并可为新肌肉周围或附近的结缔组织的再生提供基底。在各种实施方案中，提供了肌肉植入物，其包含颗粒状或片状脱细胞的肌肉基质。基质可以包含至少一些加工之前肌肉组织中通常存在的肌纤维。可选地或另外地，肌肉可以被表征为保持一定百分比的肌球蛋白。此外，肌肉虽然保留了肌纤维和/或肌球蛋白，但可以被脱细胞，如通过组织学染色测量的。在一些实施方案中，脱细胞的肌肉基质含有加工之前肌肉组织中通常存在的肌纤维或肌球蛋白的不超过约20％-80％。在某些实施方案中，肌肉植入物是以颗粒形式。在某些实施方案中，肌肉植入物是冻干的或在水性溶液中提供。在各种实施方案中，提供了一种治疗方法，包括将上述肌肉植入物之一注射或植入患者。在一些实施方案中，与不存在植入物或存在包含完整肌肉或包含缺乏基本上所有肌纤维或肌球蛋白的脱细胞的肌肉的植入物时再生的速率和/或总量相比，肌肉植入物在植入患者体内后促进了天然肌肉再生的速率和/或总量的增加。在某些实施方案中，肌肉植入物用于治疗骨骼肌缺损，诸如腹疝、腹部损伤、外科损伤、枪伤或钝力创伤。在一些实施方案中，肌肉植入物在大块肌肉的损失，例如由于肌肉萎缩疾病(musclewastingdisorder)或由于手术从患者体内移除天然肌肉组织(例如，由于肉瘤或骨肉瘤的治疗)后使用。在某些实施方案中，肌肉植入物用于增强植入部位的肌肉组织的外观和/或体积。肌肉植入物可以用颗粒状肌肉基质的一次或多于一次注射提供。肌肉植入物可用于提供功能性肌肉再生或增强，如通过收缩力测量的。附图说明图1是说明用于产生所公开的肌肉基质的示例性方法的流程图。图2A和图2B是新鲜猪肌肉和根据各种公开的实施方案制备的猪无细胞肌肉基质的组织学图像。图3是显示新鲜猪肌肉的肌球蛋白含量对比片状或颗粒形式的猪无细胞肌肉基质(pAMM)的肌球蛋白含量的条形图。图4A和图4B是产生和用猪无细胞真皮基质或猪无细胞真皮基质和猪无细胞肌肉基质的组合处理后6周的大鼠腹直肌缺损的三色染色切片。图5是具有未处理的腓肠肌缺损或用pAMM修复的腓肠肌缺损的大鼠的功能性肌肉恢复的图表，如通过奔跑距离测量的。图6是具有未处理的腓肠肌缺损或用pAMM修复的腓肠肌缺损的大鼠的功能性肌肉恢复的条形图，如通过收缩力测量的。图7A和图7B提供了缺损产生后三周时大鼠胫骨前肌(TA)肌肉缺损的三色染色图像。缺损保持不修复(A)，或在缺损产生后立即用可注射的pAMM进行修复(B)。图8是说明使用可注射pAMM修复或不修复，缺损产生后三周时TA肌肉重量的条形图，并与对侧肌肉进行比较。图9A和图9B是缺损产生12周后灵长类腓肠肌缺损的三色染色图像。缺损保持不修复(A)，或在缺损产生后立即用pAMM进行修复(B)。图10A和图10B提供了注射pAMM的大鼠TA肌肉在注射后一周或三周时的总体横截面图像。图11是植入后三周注射pAMM的大鼠TA肌肉的H&E切片，并显示新的肌肉形成。图12是注射或不注射pAMM的大鼠TA肌肉在处理后三周的条形图，显示pAMM增强现有肌肉质量的能力。图13是在注射后9周在1、2或3次处理期间注射pAMM的大鼠TA肌肉的条形图。图14示出了如实施例8中所述，经注射的肌肉与其对应的对侧肌肉相比的重量增加百分比。图15提供了如实施例8所述，注射了各种pAMM制剂的肌肉在注射后3周时的三色染色图像。没有残留量的制剂1pAMM可检测到，而少量的制剂2pAMM和制剂3pAMM是可检测到的。图16提供了如实施例8所述，注射了各种pAMM制剂的肌肉在注射后6周时的三色染色图像。没有残留量的制剂1pAMM或制剂2pAMM可检测到，而少量的制剂3pAMM是可检测到的。图17A-图17E提供了胰蛋白酶处理的猪肌肉组织的总体图像。图18是用不同浓度的胰蛋白酶处理的猪肌肉组织中剩余肌球蛋白的条形图。图19A-图19J提供了胰蛋白酶处理的、菠萝蛋白酶处理的和未处理的猪肌肉组织的总体图像。图20是用不同浓度的菠萝蛋白酶处理的猪肌肉组织中剩余肌球蛋白的条形图。某些示例性实施方案的描述现在将详细参考根据本公开内容的某些示例性实施方案，其中的某些实例在附图中示出。如本文使用的，“肌纤维”是参与肌肉收缩的杆状结构，并且包括蛋白质诸如肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和辅肌动蛋白。长肌纤维链存在于细长的肌肉细胞(肌细胞)内部及它们之间。如本文使用的，“肌肉缺损”是适于通过植入的肌肉基质而被修复、改善、增强、再生、缓解和/或治疗的任何肌肉异常或损伤。肌肉缺损包括由疾病、创伤或手术干预导致的造成肌肉改变的任何异常或损伤。如本文使用的，“大块”肌肉组织的去除或损失是指可感知且可测量的体积，例如至少约0.5cm3的体积的肌肉组织的损失。如本文使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备肌肉植入物的方法，所述方法包括：/n提供至少一种肌肉样品；/n将所述至少一种肌肉样品与含有蛋白酶的溶液接触；/n将所述至少一种肌肉样品脱细胞，以产生至少一种如用光学显微术测量的脱细胞的肌肉基质；/n以及/n加工所述肌肉基质以产生颗粒状基质，/n其中控制与含有蛋白酶的溶液的所述接触和所述脱细胞，以保留至少一些加工之前所述肌肉样品中通常存在的肌纤维。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181011 US 62/744,204;20190530 US 62/854,6471.一种制备肌肉植入物的方法，所述方法包括：
提供至少一种肌肉样品；
将所述至少一种肌肉样品与含有蛋白酶的溶液接触；
将所述至少一种肌肉样品脱细胞，以产生至少一种如用光学显微术测量的脱细胞的肌肉基质；
以及
加工所述肌肉基质以产生颗粒状基质，
其中控制与含有蛋白酶的溶液的所述接触和所述脱细胞，以保留至少一些加工之前所述肌肉样品中通常存在的肌纤维。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种肌肉样品是至少两种或至少三种肌肉样品。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种肌肉样品通过使所述样品与脱细胞溶液接触而脱细胞，所述脱细胞溶液包含聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯中的至少一种。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中控制所述酶溶液的暴露持续时间和浓度产生保留了加工之前所述肌肉样品中通常存在的肌纤维的约20％-80％的至少一种脱细胞的肌肉基质。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述至少一种肌肉样品与DNA酶接触。


6.根据权利要求1-5中任一项的方法，所述方法还包括将所述至少一种肌肉样品与α-半乳糖苷酶接触。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述至少一种肌肉样品来自缺乏基本上所有α-半乳糖部分的动物。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中加工所述肌肉基质以产生颗粒状基质包括共混、切割、均质化或冷冻断裂所述肌肉植入物以形成颗粒状肌肉植入物。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，所述方法还包括处理所述肌肉植入物以减少生物负荷。


10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述肌肉植入物暴露于电子束辐射。


11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或菠萝蛋白酶中的至少一种。


12.一种肌肉植入物，所述肌肉植入物根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备。


13.一种肌肉植入物，所述肌肉植入物包含至少一种脱细胞的肌肉基质，所述至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：辉·许，黄励婷，埃里克·斯特克，
申请(专利权)人：生命细胞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US