一种蛋白纳米载体、负载有靶向物质的载体及制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种蛋白纳米载体、负载有靶向物质的载体及制备方法和应用，属于纳米材料技术领域；所述蛋白纳米载体以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。本发明专利技术蛋白纳米载体具有良好生物相容性、较低免疫原性和较高转移效率，能选择性地刺激缺铁蛋白‑tfr1表达细胞。缺铁蛋白的pH敏感性允许流感病毒血凝素的释放。在流感病毒血凝素的帮助下，蛋白纳米载体负载的靶向物质能够逃离溶酶体，摆脱降解的命运，释放大量靶向物质进入细胞质，保证靶向物质的完整性和有效性。并且，缺铁蛋白纳米壳体没有明显毒副作用，为更安全有效地靶向递送提供了新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白纳米载体、负载有靶向物质的载体及制备方法和应用
本专利技术涉及纳米材料
，尤其涉及一种蛋白纳米载体、负载有靶向物质的载体及制备方法和应用。
技术介绍
癌症一直是危害人类生命和健康的重要原因之一。临床上常用的癌症治疗方法为化疗。化疗虽然有一定的治疗效果，但它缺乏靶向性，对正常组织细胞的损伤给患者带来极大的痛苦。目前纳米材料为靶向递送药物提供了新思路。纳米材料携带小分子药物进入癌细胞，独特的尺寸优势减少了药物在体内循环过程中的损失，在一定程度上提高了药物的治疗效率。此外，纳米载体的存在也提高了小分子药物的水溶性和稳定性。现有技术公开的纳米载体主要是金属纳米粒子，如纳米金颗粒。但是金属纳米粒子存在新陈代谢慢、容易在体内堆积的问题，脂质体体积大且不均匀，在生物安全方面仍然存在许多隐患。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛋白纳米载体、负载有靶向物质的载体及制备方法和应用，本专利技术的蛋白纳米载体生物安全性好、代谢快、递送效率高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种蛋白纳米载体，以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。优选的，所述核酸适配体包括核酸AS1411适配体。本专利技术还提供了上述方案所述蛋白纳米载体在制备靶向递送载体中的应用。本专利技术还提供了一种负载有靶向物质的载体，包括上述方案所述蛋白纳米载体和结合体，所述结合体包埋在所述蛋白纳米载体的壳体内，所述结合体为双链siRNA和核定位信号肽的结合体。优选的，所述双链siRNA是由第一RNA和第二RNA碱基互补配对得到；所述第一RNA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述第二RNA的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。优选的，所述双链siRNA的制备方法包括以下步骤：将第一RNA溶液和第二RNA溶液混合，进行碱基互补配对反应，得到双链siRNA；所述碱基互补配对反应的时间为5～6h；所述碱基互补配对反应的温度为20～30℃。本专利技术还提供了上述方案所述载体的制备方法，包括以下步骤：1)将双链siRNA、核定位信号肽、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，进行结合反应，得到结合反应产物，所述结合反应产物中包含siRNA和核定位信号肽的结合体，命名为siRNA/NLS；2)将缺铁蛋白于pH值为2～2.5的条件下进行解离，得到解离缺铁蛋白；将所述结合反应产物、流感病毒血凝素溶液和解离缺铁蛋白进行混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至7.4～7.6，进行组装，得到核壳结构，命名为Apn/siRNA/NLS/HA；3)将所述Apn/siRNA/NLS/HA、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和NHS溶液混合，得到混合液，对所述混合液进行第一透析，得到第一透析液；所述第一透析采用的透析膜的截留分子量为12～14KD；4)将所述第一透析液和核酸AS1411适配体溶液混合，进行修饰，得到修饰产物，所述修饰产物中包含所述载体。优选的，所述步骤1)中结合反应的时间为5～6h；所述结合反应的温度为20～30℃。优选的，所述组装后，还包括采用RNaseA和蛋白酶K依次对组装后的混合物进行酶解。优选的，步骤3)中所述混合的时间为1.5～2.5h。本专利技术提供了一种蛋白纳米载体，以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。在本专利技术中，核酸适配体具有靶向性，所述蛋白纳米载体在核酸适配体的靶区进入细胞，转移效率高。缺铁蛋白壳体能够包埋靶向物质，溶酶体的酸性环境导致缺铁蛋白壳体被破坏，包埋的靶向物质和流感病毒血凝素释放。流感病毒血凝素能破坏溶酶体膜，使靶向物质逃离溶酶体，最大限度地保持靶向物质的完整性。缺铁蛋白纳米壳体能够选择性地刺激缺铁蛋白-tfr1表达细胞，且没有明显毒副作用，使得蛋白纳米载体具有良好的生物相容性和较低的免疫原性。附图说明图1表示本专利技术蛋白纳米载体药物释放和装载的过程示意图；图2为缺铁蛋白的透射电镜图像；图3为本专利技术实施例中蛋白纳米载体的透射电镜图像；图4为缺铁蛋白和本专利技术实施例中蛋白纳米载体的大小变化；图5为缺铁蛋白和本专利技术实施例中蛋白纳米载体的Zeta电位变化；图6为37℃的条件下，分别检测pH5.5和pH7.4下缺铁蛋白中siRNA的体外释放情况；图7为缺铁蛋白、缺铁蛋白/siRNA、缺铁蛋白/siRNA/Apt、Apn/siRNA/核定位信号肽/Apt、缺铁蛋白/siRNA/HA/Apt和Apn/siRNA/NLS/HA/Apt对MCF-7细胞的毒性作用；图8为细胞内缺铁蛋白/Cy5siRNA/NLS/HA/Apt的荧光检测；其中a表示MCF-7细胞，b表示MCF-7细胞+缺铁蛋白/Cy5siRNA/NLS/HA/Apt；图9为细胞的共聚焦显微镜图像；A组为缺铁蛋白与细胞共同孵育6h，B组为Apn/Cy5-siRNA/NLS/HA/Apt与细胞共同孵育6h，C组为Apn/Cy5-siRNA/NLS/HA/Apt与细胞共同孵育12h。具体实施方式本专利技术提供了一种蛋白纳米载体，以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。在本专利技术中，所述缺铁蛋白优选的购自于sigma公司。在本专利技术中，所述核酸适配体优选的包括核酸AS1411适配体。在本专利技术中，所述核酸AS1411适配体的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述核酸AS1411适配体能精确靶向定位MCF-7乳腺癌细胞；所述流感病毒血凝素(HA)的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。在本专利技术中，所述缺铁蛋白的质量和核酸AS1411适配体的摩尔的比例优选为(8～12)g：0.1mmol，进一步优选为10g：0.1mmol；所述缺铁蛋白的质量和流感病毒血凝素的摩尔的比例优选为(8～12)g：0.1mmol，进一步优选为10g：0.1mmol。在本专利技术中，所述蛋白纳米载体优选的采用以下方法制备得到：S1.将缺铁蛋白于pH值为2～2.5的条件下进行解离，得到解离缺铁蛋白；将流感病毒血凝素溶液和解离缺铁蛋白进行混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至7.4～7.6，进行组装，得到核壳结构，命名为Apn/HA；S2.将所述Apn/HA、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和NHS溶液混合，得到混合液，对所述混合液进行第一透析，得到第一透析液；所述第一透析采用的透析膜的截留分子量为12～14KD；S3.将所述第一透析液和核酸AS1411适配体溶液混合，进行修饰，得到修饰产物，所述修饰产物中包含蛋白纳米载体。本专利技术首先将缺铁蛋白于pH值为2～2.5的条件下进行解离，得到解离缺铁蛋白；将流感病毒血凝素溶液和解离缺铁蛋白进行混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至7.4～7.6，进行组装，得到核壳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白纳米载体，以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白纳米载体，以核酸适配体修饰的缺铁蛋白为壳体，包埋有流感病毒血凝素。


2.根据权利要求1所述的蛋白纳米载体，其特征在于，所述核酸适配体包括核酸AS1411适配体。


3.权利要求1或2所述蛋白纳米载体在制备靶向递送载体中的应用。


4.一种负载有靶向物质的载体，包括权利要求1或2所述蛋白纳米载体和结合体，所述结合体包埋在所述蛋白纳米载体的壳体内，所述结合体为双链siRNA和核定位信号肽的结合体。


5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述双链siRNA是由第一RNA和第二RNA碱基互补配对得到；所述第一RNA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述第二RNA的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述双链siRNA的制备方法包括以下步骤：将第一RNA溶液和第二RNA溶液混合，进行碱基互补配对反应，得到双链siRNA；所述碱基互补配对反应的时间为5～6h；所述碱基互补配对反应的温度为20～30℃。


7.权利要求4～6任意一项所述载体的制备方法，包括以下步骤：
1)将双链siRNA、核定位信号肽、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭英姝，曹秀萍，尚鑫鑫，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37