一种AureobasidinA的发酵制备方法及其培养基技术

本发明专利技术涉及微生物制药技术领域，具体涉及一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基，特别是适用于Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887的发酵制备方法及其培养基。上述方法和培养基，通过对工艺路线、工艺条件、种子培养基、发酵培养基(尤其是添加碳源调节因子，例如异丙基氯化镁)等进行优化，可显著提高Aureobasidin A的合成效率，维持产率稳定，延长产物合成周期，使Aureobasidin A的产量显著提升，可达5.5g/L以上，有利于Aureobasidin A的工业化生产。的工业化生产。的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基


[0001]本专利技术涉及微生物制药
，具体涉及一种Aureobasidin A的发酵制备方法及其培养基，特别是适用于Aureobasidin A高产菌株CGMCC NO.20887的发酵制备方法及其培养基。

技术介绍

[0002]AureobasidinA是一种由9个氨基酸分子组成的环脂肽类抗生素，最早在1991年由日本Kazutoh Takesako团队从黑酵母Aureobasidiumpullulans的培养液中分离获得。后续研究证实AureobasidinA具有非常强的抗真菌能力，其在0.1～0.5μg/ml的低浓度下即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括：出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(Aspergillus niger)。AureobasidinA的作用机制是抑制真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide，IPC)合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而进一步杀死菌株。但是，AureobasidinA不会破坏DNA、RNA和蛋白质的合成。
[0003]目前，有关AureobasidinA生产技术的报道较少。1991年，KazutohTakesako团队最先从对马岛的叶子中分离到了Aureobasidiumpullulans菌种，经发酵培养后AureobasidinA的产量约为140μg/ml，通过培养基优化后(添加不同氨基酸)产量最高为312μg/ml(Kazutoh Takesako,Shigetoshi Mizutani,Hitoshi Sakakibara,et al.1996，Precursor Directed Biosynthesis ofAureobasidins)。2008年，Ahmed Abdel
‑
Lateff等人从波塞多尼亚附近海域分离到一株海洋微生物Aureobasidium sp.，其发酵单位不超过300μg/ml。AureobasidinA因其较强的抗真菌活性，应用领域由潜在人用药逐步扩大到生物农药，因此，AureobasidinA高水平生产技术开发具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种Aureobasidin A的制备方法。
[0005]具体地，上述方法包括如下步骤：
[0006](1)菌种活化；
[0007](2)菌悬液制备；
[0008](3)种子扩培；
[0009](4)发酵。
[0010]具体地，上述步骤(1)包括：将Aureobasidin A生产菌株接种至固体培养基，培养，获得菌苔。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，上述Aureobasidin A生产菌株为菌株CGMCC NO.20887。
[0012]具体地，上述固体培养基可以为任何适合真菌培养的培养基，例如，PDA培养基。
[0013]具体地，步骤(1)中的培养温度可以为20
‑
30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22
‑
30℃，24
‑
26℃，25℃。
[0014]具体地，步骤(1)中的培养湿度可以为40～70％相对湿度(例如40％、50％、60％、70％相对湿度)。
[0015]具体地，步骤(1)中的培养时间可以为1
‑
10天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天)，例如3
‑
6天，4天。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，上述步骤(1)包括：取Aureobasidin A生产菌株的菌种甘油管，30℃水浴解冻，混匀后取菌悬液接种到PDA培养基平板，于22
‑
30℃、40
‑
70％相对湿度的培养箱内倒置培养3
‑
6天，获得菌苔。
[0017]具体地，上述步骤(2)包括：将步骤(1)活化后所得菌种用溶剂稀释，分散，得到菌悬液。
[0018]具体地，上述溶剂可以为无菌生理盐水。
[0019]具体地，对于上述菌悬液的浓度，每板菌苔可以用10
‑
20ml(例如10、12、14、16、18、20ml)溶剂稀释。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，上述步骤(2)包括：取生长好且质量合格的平板菌苔(例如丰厚饱满的菌苔，呈奶油色或橄榄绿)，用无菌生理盐水洗下，转移至加有玻璃珠的三角瓶中，振荡，打散混匀后获得菌悬液。
[0021]具体地，上述步骤(3)包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，一级培养，然后取一级培养液接种入二级种子培养基中，二级培养。
[0022]具体地，上述一级培养中，接种量可以为0.05
‑
1％(体积百分比，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％)，例如0.1
‑
1％，0.2
‑
0.8％，0.4
‑
0.6％，0.5％。
[0023]具体地，上述一级培养中，培养温度可以为20
‑
30℃(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃)，例如22
‑
30℃，24
‑
26℃，25℃。
[0024]具体地，上述一级培养中，培养时间可以为15
‑
72h(例如16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、42、48、54、60、66、72h)，例如15
‑
30h。
[0025]具体地，上述一级培养中，培养pH可以为1.5
‑
8.0(例如1.5、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)，特别是5.5
‑
6.5。
[0026]具体地，上述一级培养可以在三角瓶中进行。
[0027]具体地，上述一级培养为振荡培养，振荡频率可以为100
‑
300rpm(例如100、150、160、180、200、210、220、230、240、250、300rpm)，例如180
‑
250rpm。
[0028]在本专利技术的一个实施例中，一级培养包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，摇瓶培养，接种量为0.1
‑
1％，摇床转速为180
‑
250rpm，种龄15
‑
30h。
[0029]具体地，上述二级培养中，接种量可以为0.05
‑
1％(体积百分比，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Aureobasidin A的制备方法，其包括如下步骤：(1)将Aureobasidin A生产菌株进行菌种活化；(2)菌悬液制备；(3)种子扩培；(4)发酵；其中，所述步骤(3)包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，一级培养，然后取一级培养液接种入二级种子培养基中，二级培养。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级培养中，接种量为0.05
‑
1％，培养时间为15
‑
72h；优选地，所述一级培养包括：将步骤(2)所得菌悬液接种入一级种子培养基中，摇瓶培养，接种量为0.1
‑
1％，摇床转速为180
‑
250rpm，种龄15
‑
30h。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二级培养中，接种量为0.05
‑
1％，培养时间为8
‑
60h；优选地，所述二级培养包括：将一级种子培养液接种入二级种子培养基中，在种子罐进行扩培，接种量为0.05
‑
0.5％，搅拌转速为150
‑
300rpm，溶氧≥30％，种龄15
‑
30h。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养中，接种量为0.5
‑
20％，溶氧值为5
‑
50％；优选地，所述发酵培养包括：将经过步骤(2)扩培的种子培养液，接种入发酵培养基，发酵培养4天以上，移种量为0.5
‑
10％，搅拌转速200
‑
400rpm、溶氧值10
‑
40％。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述Aureobasidin A生产菌株为菌株CGMCC NO.20887。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Aureobasidin A生产菌株的培养温度为20
‑
30℃，pH为1.5
‑
8.0；优选地，所述Aureobasidin A生产菌株的培养温度为24
‑
26℃，pH为5.5
‑
6.5。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所用种子培养基包含：葡萄糖1
‑
10％，酵母提取物0.1
‑
5％；或，所述种子培养基包含：葡萄糖1
‑
5％，淀粉0.5
‑
5％，酵母提取物0.1
‑
4％，玉米浆0.1
‑
1％，磷酸氢二钾0.05
‑
0.5％、硫酸镁0.01
‑
0.1％、氯化钠0.05
‑
0.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱进伟，彭湘屏，张敏，王雪峰，孙琼，石磊，汪超，陈世敏，高祥，
申请(专利权)人：浙江珲达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：