一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒技术

本发明专利技术涉及分析检测技术领域，提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒。本发明专利技术采用芴甲氧羰酰氯对含氨基小分子蘑菇毒素进行衍生化，并使用二氯甲烷进行富集净化，通过液相色谱串联质谱对待测液进行分析。本发明专利技术采用芴甲氧羰酰氯对含氨基小分子蘑菇毒素进行衍生化，衍生反应速度快，所需时间短，效率远高于现有检测方法，并且衍生化产物的色谱峰峰形及分离度能够得到有效改善和提高，明显提高了方法的准确度和灵敏度；本发明专利技术将含氨基小分子蘑菇毒素衍生物进行富集净化，能够减少样品的基质效应，提高检测结果的准确性。本发明专利技术提供的试剂盒能够方便快捷的实现含氨基小分子蘑菇毒素的检测。氨基小分子蘑菇毒素的检测。氨基小分子蘑菇毒素的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒


[0001]本专利技术涉及分析检测
，尤其涉及一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来因误食野生蘑菇引发的中毒事件在我国呈蔓延趋势，引起社会广泛关注，也成为食品安全领域极为突出的问题。2020年国家食品安全风险评估中心基于我国食源性疾病暴发监测系统的数据统计发现，2003～2017年间31.8％的食源性中毒事件由毒蘑菇中毒引起，位居各类食源性中毒诱发因素之首。目前已鉴定出的蘑菇毒素有100多种，涉及环肽类及小分子类化合物等。其中鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid)是一种小分子氨基酸类蘑菇毒素，毒蝇母(Muscimol)为其脱羧基的化合物。这两种毒素的主要产毒菌为毒蝇鹅膏菌(Amanita muscaria)和豹斑鹅膏菌(Amanita pantherina)。摄入该类毒蘑菇后呈现出神经精神类症状，表现为头晕、紧张、兴奋、知觉改变、肌肉抽搐等。在体内鹅膏蕈氨酸可迅速以母体形式排泄至尿液，部分会转化为毒蝇母。另外日本学者Yamaura等从球基鹅膏菌中分离出两种致死小分子氨基酸类蘑菇毒素：2
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氨基
‑5‑
己炔酸(2
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amino
‑5‑
hexynoic acid)和2
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氨基
‑4‑
戊炔酸(2
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amino
‑4‑
pentynoic acid)(Toxicology,1986,38,161
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173)。这两种氨基酸类蘑菇毒素具有较强的水溶性和极性，但其在动物体内的代谢和致死机理尚未明确。鉴于我国毒蘑菇中毒事件频发的现状，开发稳健的蘑菇毒素检测方法，对蘑菇毒素的溯源以及毒蘑菇的鉴定具有重要意义。
[0003]目前，国内外关于鹅膏蕈氨酸和毒蝇母的检测方法仅有少量研究，尚无2
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氨基
‑5‑
己炔酸和2
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氨基
‑4‑
戊炔酸检测方法的任何报道。利用液相色谱串联质谱法定量检测鹅膏蕈氨酸和毒蝇母已有报道(Forensic Toxicology,2013,322
‑
327；食品安全质量检测学报,2019,22,7656
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7664)。然而这两种毒素在电喷雾离子源中均只产生一个有效二级质谱产物离子(鹅膏蕈氨酸：159
→
113；毒蝇母：115
→
98)，定性能力较差，极易产生假阳性结果。Kenji Tsujikawa等采用丹磺酰氯对鹅膏蕈氨酸和毒蝇母进行两步衍生化，整个衍生化时间约为150min，衍生化产物通过液相色谱紫外检测(Journal of chromatography B,2007,852,430
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435)。Xu等采用类似的衍生化方案在5％NaHCO3条件下60℃反应30min生成2
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丹磺酰氯
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鹅膏蕈氨酸和2
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丹磺酰氯
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毒蝇母，然后通过液相色谱串联质谱法进行定量(Journal of Chromatography B,2020,1146,122128)。然而，此类衍生化方法需进行加热处理、反应时间长、操作繁琐，且仅对鹅膏蕈氨酸和毒蝇母进行检测，对2
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氨基
‑5‑
己炔酸和2
‑
氨基
‑4‑
戊炔酸等致死性小分子蘑菇毒素不能进行检测。
[0004]鉴于此，开发一种操作简单且定量准确的含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法是亟需解决的技术难点。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法以及一种试剂
盒。本专利技术提供的检测方法前处理简单、省时快捷、灵敏度和准确度高。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，包括以下步骤：
[0008](1)将待测样本用提取溶剂进行提取，将所得提取液离心，得到上清液；
[0009](2)将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，将所得衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液；所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；
[0010](3)将所述下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液；
[0011](4)将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液；
[0012](5)将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图，根据谱图峰面积和标准曲线计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物峰面积的关系曲线。
[0013]优选的，所述含氨基小分子蘑菇毒素为鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2
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氨基
‑5‑
己炔酸、2
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氨基
‑4‑
戊炔酸和2
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氨基
‑
4,5
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己二烯酸中的一种或几种。
[0014]优选的，所述待测样本为蘑菇、尿液或血浆，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈水溶液或甲醇水溶液；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈；所述提取为超声提取或振荡提取，所述提取的时间为5～10min。
[0015]优选的，所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液的体积比为1～5:1:1～2；所述四硼酸钠缓冲液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述四硼酸钠缓冲液的pH值为8～9；所述芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为0.5～5mg/mL；所述衍生化反应的温度为25～45℃，时间为10～20min。
[0016]优选的，所述第一萃取的次数为1～3次，单次萃取用有机溶剂和衍生化反应液的体积比为1～3:1。
[0017]优选的，调节所述下层溶液pH值用调节剂为盐酸溶液，将所述下层溶液的pH值调节至2～3；所述下层溶液和二氯甲烷的体积比为1:1～2。
[0018]优选的，所述复溶用溶剂为甲醇水溶液。
[0019]优选的，所述液相色谱串联质谱分析使用的质谱为三重四级杆质谱，采用的模式为多反应监测质谱模式；
[0020]所述液相色谱串联质谱分析的液相色谱条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，流动相B为含氨水的醋酸铵水溶液，所述含氨水的醋酸铵水溶液中氨水的质量分数为0.05％，醋酸铵的浓度为5mmol/L；流动相的流速为0.3～0.4mL/min；色谱柱为ZORBAX eclipse plus C18柱，柱温为40℃；
[0021]所述液相色谱串联质谱分析的质谱条件包括：检测方式为电喷雾离子源负离子模式，喷雾电压为
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含氨基小分子蘑菇毒素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样本用提取溶剂进行提取，将所得提取液离心，得到上清液；(2)将所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液混合进行衍生化反应，将所得衍生化反应液用有机溶剂进行第一萃取，得到下层溶液；所述有机溶剂包括正戊烷、正己烷、环己烷和石油醚中的一种或几种；(3)将所述下层溶液的pH值调节至酸性，然后用二氯甲烷进行第二萃取，得到二氯甲烷萃取液；(4)将所述二氯甲烷萃取液用氮气吹干后复溶，得到待测液；(5)将所述待测液进行液相色谱串联质谱分析，得到谱图，根据谱图峰面积和标准曲线计算得到待测样本中含氨基小分子蘑菇毒素的含量；所述标准曲线为含氨基小分子蘑菇毒素浓度和含氨基小分子蘑菇毒素衍生化产物峰面积的关系曲线。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含氨基小分子蘑菇毒素为鹅膏蕈氨酸、毒蝇母、2
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氨基
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己炔酸、2
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氨基
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戊炔酸和2
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氨基
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4,5
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己二烯酸中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本为蘑菇、尿液或血浆，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈水溶液或甲醇水溶液；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈；所述提取为超声提取或振荡提取，所述提取的时间为5～10min。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述上清液、四硼酸钠缓冲液和芴甲氧羰酰氯溶液的体积比为1～5:1:1～2；所述四硼酸钠缓冲液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述四硼酸钠缓冲液的pH值为8～9；所述芴甲氧羰酰氯溶液的浓度为0.5～5mg/mL；所述衍生化反应的温度为25～45℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志勇，赵晓燕，张艳梅，鄂恒超，范婷婷，周昌艳，李晓贝，陈磊，董慧，杨宪立，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：