一种基因工程菌及其构建方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种基因工程菌及其构建方法和用途。通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉，获得高表达PKS17的基因工程菌，例如，MCA17。该基因工程菌的发酵产物为新化合物MCA17

【技术实现步骤摘要】
RNA的表达。该药具有嗜肝活性，能选择性阻止肝内胶原合成而对其他器官无影响。但该药Ⅱ期临床研究时发现可致白内障，因此已终止临床研究。
[0009]作为微生物、植物和动物的次级代谢产物，天然产物往往具有很好的生物活性，是药物发现最主要的灵感源泉。相对于化学合成的小分子化合物，次级代谢产物生产方式更加环保，毒副作用小。近三十年来，FDA批准的临床药物里有超过50％来源于天然产物及其衍生物(包含超过70％的抗生素以及50％的抗肿瘤药物)。但是，在肝纤维化抑制剂的研究中，直接来源于微生物的候选化合物几乎没有。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术提供了一种基因工程菌，是通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)得到的，该基因工程菌的发酵产物为新型化合物MCA17
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1，其唯一手性中心为S
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构型。在TGF
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β诱导的肝星状细胞肝纤维化模型中，化合物MCA17
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1在1μM下即可显著抑制星状细胞活化，有望成为治疗纤维化的候选药物。
[0011]为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0012]本专利技术的第一个方面在于提供一种基因工程菌，为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，PKS17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]就本专利技术的上述目的，所述基因工程菌命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
[0014]本专利技术的第二个方面在于提供上述基因工程菌的构建方法，包括：利用pFGL表达载体和强启动子tef1p，构建pFGL
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tef1p
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PKS17表达载体；通过农杆菌转化方法将pFGL
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tef1p
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PKS17转化进入齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)ΔaurA突变体中，并在齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)ΔaurA突变体中高表达PKS17。
[0015]就本专利技术的上述目的，pFGL
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tef1p
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PKS17表达载体通过以下步骤构建：
[0016]以齿梗孢霉的基因组DNA为模板，利用三对引物分别PCR扩增基因簇17中的骨架基因PKS17，得到三段PCR产物；将纯化后的三段PCR产物与BamHI消化的pFGL
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neoR
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tef1p用无缝克隆试剂拼接，形成pFGL
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tef1p
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PKS17；
[0017]其中，所述三对引物分别为：
[0018]第一引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0019]第二引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
[0020]第三引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0021]本专利技术的第三个方面在于提供上述基因工程菌的用途，包括：将所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物，命名为MCA17
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1；MCA17
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1的结构如下式(Ⅲ)所示，其具有内酰胺结构，唯一手性中心为S
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构型；
[0022][0023]就本专利技术的上述目的，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1～5％接种量接种于到发酵培养基，在25～30℃、150～200rpm条件下，发酵10～15天，经分离纯化得到化合物MCA17
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1。
[0024]就本专利技术的上述目的，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1％接种量接种于到发酵培养基，在25℃、150rpm条件下，发酵14天，经分离纯化得到化合物MCA17
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1。
[0025]就本专利技术的上述目的，所述的基因工程菌为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17。
[0026]就本专利技术的上述目的，所述用途还包括：将所述化合物MCA17
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1或其衍生物用于制备抗肝纤维化活性的药物，尤其是天然产物药物。
[0027]就本专利技术的上述目的，所述化合物MCA17
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1或其衍生物通过抑制由TGF
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β诱导的肝星状细胞LX2的活化来抑制肝纤维化活性。
[0028]就本专利技术的上述目的，所述用途还包括：将化合物MCA17
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1或其衍生物用于制备抗肺纤维化活性或抗肾脏纤维化活性的药物，尤其是天然产物药物。
[0029]本专利技术中，通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)，获得高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的基因工程菌，例如，MCA17。该基因工程菌的发酵产物为新化合物MCA17
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1，其唯一手性中心为S
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构型，体外细胞实验显示，化合物MCA17
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1在1μM下即可显著抑制星状细胞活化，其本身或其衍生物有望成为治疗纤维化的候选药物。由于化合物MCA17
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1可以通过该基因工程菌大规模发酵得到，成本低，环境污染少，因此，该基因工程菌和发酵产物在抗纤维化活性的药物制备中具有很好的应用开发前景。
[0030]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0031]本专利技术首次构建了齿梗孢霉ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，并利用其发酵得到唯一手性中心为S
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构型的化合物MCA17
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1，而化合物MCA17
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1具有高强度抑制纤维化活性的优异性能，可用于制备肝、肺、肾脏等纤维化抑制剂及其相关药物。利用基因工程菌发酵制备抑制剂，易于大规模生产、成本低、环境污染少，且分离纯化简单，具有很好的应用开发前景。
[0032]生物材料的保藏
[0033]本专利技术的基因工程菌，命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
附图说明
[0034]图1为基因簇17的骨架基因PSK17的结构示意图。
[0035]图2为实施例2中出发菌株与重组转化子的HPLC谱图。
[0036]图3为实施例3得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为齿梗孢霉ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，PKS17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。3.如权利要求1～2中任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：利用pFGL表达载体和强启动子tef1p，构建pFGL
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tef1p
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PKS17表达载体；通过农杆菌转化方法将pFGL
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tef1p
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PKS17转化进入齿梗孢霉ΔaurA突变体中，并在齿梗孢霉ΔaurA突变体中高表达PKS17。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，pFGL
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tef1p
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PKS17表达载体通过以下步骤构建：以齿梗孢霉的基因组DNA为模板，利用三对引物分别PCR扩增基因簇17中的骨架基因PKS17，得到三段PCR产物；将纯化后的三段PCR产物与BamHI消化的pFGL
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neoR
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tef1p用无缝克隆试剂拼接，形成pFGL
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tef1p
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PKS17；其中，所述三对引物分别为：第一引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；第二引...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛旭明，李佳，臧奕，程锦涛，李永泉，王瀚敏，谢荣荣，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：