一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及制备方法技术方案

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及制备方法。本发明专利技术还提供了所述的可控适配体在精准靶向治疗癌症的纳米递药系统中的应用。实验证明，本发明专利技术的抑制链可控制适配体的靶向功能，提高适配体的靶向肿瘤细胞的精准度。并通过制备了基于DNA结构的纳米递药系统，将抗癌药物精准递送到肿瘤细胞，减轻对正常细胞的伤害。

【技术实现步骤摘要】
一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、纳米递药系统及制备方法
本专利技术属于生物
，提供了一种用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链、核酸适配体介导的精准靶向肿瘤细胞的纳米递药系统及制备方法。
技术介绍
目前癌症常用的治疗方法有手术治疗，放射治疗和药物治疗，其中手术治疗是主要的治疗手段，然而大部分病人被确诊时已进入中晚期，单纯手术治疗作用有限，因此药物治疗在肺癌治疗中占有极其重要的地位。然而目前的研究表明，当前化疗药物的使用并没有使患者的中位生存期有明显的延长，且目前的化疗药物均存在较大的毒副作用，因此，如何减小化疗药物的毒副作用是一个非常重要的问题。受体介导的主动靶向技术是增加药物靶向性，降低药物毒副作用的主要技术手段。核酸适配体因热稳定性好，易于合成，无免疫原性，易于修饰等优点成为主动靶向分子的研究热点。适配体AS1411是一条拥有规则碱基排列顺序的富含鸟嘧啶(G)寡核苷酸链，能够形成G-四链体结构使其在体内不易被血清酶降解。四链体的稳定构象使AS1411能够以高亲和力和特异性与肿瘤标志物核仁素结合。因此，AS1411在递药系统中被广泛应用，以提高递药系统的靶向能力。但是，大多数肿瘤标志物并不是只在肿瘤细胞上表达，它在正常细胞中也有所表达。因此，尽管给载体修饰了靶向分子，在癌症治疗中，对正常细胞产生的杀伤作用依然值得重视。由于缺氧环境和呈现酸性的细胞器，肿瘤细胞会产生乳酸使得pH值比正常组织周围低。正常生理pH值在7.4左右，肿瘤组织周围pH值在6.4-7.2之间。I-motif是一条碱基序列规则的富含胞嘧啶(C)的寡核苷酸链，其序列特征为连续的C序列(Cn)和A、T碱基序列(T-loop)交替规则排列。在满足pH范围的条件下，Cn序列中的C的氨基被质子化，两个C之间可形成半质子化碱基对C-H+-C，4段Cn序列之间则可形成C-四链体构型，而且i-motif的pH响应范围可以通过调整Cn序列中C的个数和T-loop中A和T的个数和顺序来改变。利用i-motif和靶向肿瘤标志物核仁素的适配体AS1411的碱基序列的特殊性，i-motif可以与AS1411结合，抑制AS1411在正常生理环境中的靶向能力，减少药物对正常细胞产生的杀伤。在肿瘤细胞酸性环境下i-motif结构变化，形成C-四链体结构，从而与AS1411解离，使得AS1411恢复靶向核仁素的能力，从而达到精准靶向肿瘤细胞的效果。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中的问题，本专利技术的目的之一是提供用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链，旨在提高AS1411靶向肿瘤细胞的精准度，而不会对正常组织或者细胞产生较大的伤害。用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，满足以下要求：(1)含i-motif结构；(2)在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型；(3)含有与核酸适配体部分序列互补配对的序列。i-motif是富含胞嘧啶(C)的寡核苷酸链，其序列特征为连续的C序列(Cn)和A、T碱基序列(T-loop)交替规则排列；在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型，而且其pH响应范围可以通过调整Cn序列中C的个数和T-loop中A和T的个数和顺序来改变。所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其中i-motif序列为5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCC-3’，见SEQIDNO.1。所述的核酸适配体为AS1411，命名链S-A，序列为5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，见SEQIDNO.2。所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链，还包含与核酸适配体AS1411部分序列5’-GGTGGTGGT-3’(见SEQIDNO.3)互补的序列5’-ACCACCACC-3’(见SEQIDNO.4)。所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，碱基序列为5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’，见SEQIDNO.5。所述的DNA链S-I应用时，和含核酸适配体AS1411的DNA结构结合形成载体A-I-Duplex，A-I-Duplex由链S-D-A、S-D、S-I三条链组装而成；序列分别如下：S-D-A：5’-CATTGGTACAGAATCGCATGGATGCTGACTGGGGGGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’；见SEQIDNO.6，S-D：5’-AGTCAGCATCCATGCGATTCTGTACCAATG-3’，见SEQIDNO.7。S-D-A是在S-A的5端延长了35个碱基而成的。本专利技术的目的之二是提供上述的DNA链在制备核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种精准的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统，包含上述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链和上述的核酸适配体AS1411的DNA结构，以及药物。所述的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统中的药物包括：盐酸多柔比星、亚甲基蓝、放线菌素D中的至少一种。药物负载在核酸适配体AS1411的DNA双螺旋中。本专利技术的第四个目的是提供所述的精准的核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统的制备方法，包括以下步骤：(1)合成A-I-Duplex在PBS缓冲溶液中依次加入三条链S-I、S-D-A和S-D，混匀后，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下持续5min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜；(2)负载药物将药物溶液和A-I-Duplex溶液加于PBS缓冲液，摇匀负载，即得到核酸适配体介导的靶向肿瘤细胞的纳米递药系统。进一步的，所述的制备方法，包括以下步骤：(1)合成A-I-Duplex在0.1M，pH7.4的PBS缓冲溶液中加入等量相同浓度的三条链S-I、S-D-A和S-D，涡旋30s-1min后，置于PCR热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下持续5min后，置于冰上快速冷却至0℃，最后于4℃冰箱静置过夜；(2)负载抗癌药物Dox·HCl将Dox·HCl溶液和A-I-Duplex以1:1-12.5:1(优选12.5:1)的摩尔比加于0.1M，pH7.4的PBS缓冲液，避光条件下，置于摇床上摇晃3h-24h(优选3h)即得到递药系统A-I-Duplex@Dox。配制盐酸多柔比星溶液(即Dox·HCl)时，具体方法如下：将固体盐酸多柔比星(Dox·HCl,5.8mg,10mmol)溶解在1mL纯水中，然后稀释100倍制成浓度为100μM的Dox·HCl溶液。A-I-Duplex@Dox载药体系获得，具体方法如下：Dox·HCl溶液(100μM)和A-I-Duplex(10μM)以12.5:1的摩尔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，满足以下要求：/n(1)含i-motif结构；/n(2)在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型；/n(3)含有与核酸适配体部分序列互补配对的序列。/n

【技术特征摘要】
1.用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，满足以下要求：
(1)含i-motif结构；
(2)在pH值6.4-7.0体系范围内，i-motif会形成C-四链体构型；
(3)含有与核酸适配体部分序列互补配对的序列。


2.根据权利要求1所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，i-motif序列为5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCC-3’。


3.根据权利要求1所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，所述的核酸适配体为AS1411，命名链S-A，序列为：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。


4.根据权利要求1所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，还包含与核酸适配体AS1411部分序列5’-GGTGGTGGT-3’互补的序列5’-ACCACCACC-3’。


5.根据权利要求4所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链S-I，其特征在于，S-I碱基序列为
5’-CCCCTTACCCCTTACCCCTTACCCCACCACCACC-3’。


6.根据权利要求5所述的用于抑制核酸适配体靶向能力的DNA链，其特征在于，所述的DNA链S-I应用时，和含核酸适配体AS1411的DNA结构结合形成载体A-I-Duplex，A-I-Duplex由链S-D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳飞，胡雅琴，刘珍宝，彭东明，刘晓钦，王怡蓉，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43