引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用，其中第一引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，第二引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，第二引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；第三引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，第三引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；集中于同一病毒样颗粒中可表达式可以同时表达，具有多亚基蛋白结构，且其保留了自组装的能力，没有遗传物质，但模仿了天然病毒颗粒的整体结构且没有传染性。

【技术实现步骤摘要】
引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种引物组，引物组在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒中的应用，其中重组杆状病毒样颗粒的表达是基于Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。
技术介绍
猪轮状病毒(RotavirusRV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus)成员，为无囊膜的二十面体粒子，直径约为66-75nm，基因组大小为18,522bp，由11个分节段的双链RNA(dsRNA)组成，编码6个结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和5或6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。根据VP6蛋白的抗原性，轮状病毒(RV)分为9个不同的血清型(RVA-RVJ)，其中RVB、RVC、RVE、RVH和RVI可以感染各种哺乳动物，RVA、RVB、RVC、RVE和RVH可以感染猪，RVA、RVB、RVC、RVH可以感染人，而RVD、RVF和RVG可以感染家禽，如鸡和火鸡。根据两种含有中和抗原表位的外衣壳蛋白VP7和VP4，可将轮状病毒分为不同的G和P基因型，35种G和50种P基因型已在世界各地被报道。根据不同的血清型和VP7、VP4基因型，RCWG建议轮状病毒的命名方式为RVgroup/来源/分离鉴定的地区/名字/分离鉴定的时间/G型P型。该轮状病毒是引起婴幼儿和幼畜急性非细菌性腹泻的重要病原之一。该轮状病毒感染宿主范围广泛，包括人、猪、牛、羊、兔、犬及多种畜禽等。该猪轮状病毒可引起婴幼儿及各品种幼龄动物发生非细菌性腹泻，并导致较高的死亡率。5岁以下的婴幼儿因轮状病毒而发生的急性腹泻和死亡占儿科肠道感染病例的50％以上。数据表明发展中国家，每年平均有527000个儿童因感染轮状病毒而死亡。我国以前每年因轮状病毒感染而发生腹泻的儿童住院率高达13％。给我国公共卫生事业造成了严重的危害。诸多发于8周龄以内的仔猪并且猪的轮状病毒感染具有明显的季节性多发于每年12月份至翌年1-2月，夏季也有该病爆发的报道。并且各种年龄、性别的猪都可感染轮状病毒。一周龄内的仔猪在无母源抗体保护的情况下，感染轮状病毒后死亡率高达100％，随着年龄的增长，猪感染轮状病毒的症状有所减轻。20日龄哺乳仔猪感染轮状病毒后症状较轻，死亡率也较低，常呈耐过状态或隐形带毒。仔猪轮状病毒腹泻是一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的传染病，常爆发于两个阶段，第一，它易发生在哺乳期，尤其是缺乏母源抗体的后备母猪所生产的仔猪。第二，轮状病毒常引起断奶仔猪发生腹泻，因为断奶致使母源抗体突然丢失，仔猪抵抗力降低而出现感染。RVA毒株至少鉴定出了11种不同G型，其中G5型(45.8％)是目前最流行的基因型，其次是G3型(11.2％)和G4型(9.6％)，在17种不同的P型中最普遍的是P[7]型(47.4％)，其次是P[6]型(15.9％)和P[13]型(3.2％)，在47种不同的G型和P型的组合中最常见的是G5P[7]型(37.4％)(Pappetal.2013)。在轮状病毒的9种不同的分型中，G5型RVA被认为是最普遍和最流行的毒株。目前主要应用的是传统的灭活苗和弱毒苗。灭活疫苗制造工艺简单，性质比较稳定，易于保存和运输。但是灭活疫苗在灭活过程中可能损害或改变有效的抗原决定簇，因而可能需要抗原量大，成本比较高。弱毒活疫苗在仔猪体内可以增值，有较好的保护性，但弱毒活疫苗在动物体内有毒力返祖的潜在危险性，可能形成潜在感染或传播。传统疫苗的不稳定性，就迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫机制来预防和控制RV感染发病。
技术实现思路
针对传统的灭活苗在灭活过程中可能损害或改变有效的抗原决定簇，因而可能需要抗原量大，成本比较高；弱毒苗在动物体内有毒力返祖的潜在危险性，可能形成潜在感染或传播的问题，本专利技术提供一种引物组。本专利技术的技术方案为：一种引物组，包括第一引物、第二引物以及第三引物；其中第一引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGGCGTACAGGAAGCGYGG，第一引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTTTACAGTTCGTTCATDATGCGC；第二引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGGAGGTTCTGTACTCATTG，第二引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTTCACTTAATCAACATGCTTCTA；第三引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGTATGGTATTGAATATACCA，第三引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTCTAAACTCGRTARTARAATGC。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：该引物组具有良好的特异性，使得构建得到的VP2基因、VP6基因以及VP7基因能够准确表达得到相应的目的蛋白；引物用于前期质粒的正确构建，对后期的成功表达有一定的影响，是后期穿梭质粒感染细胞成功表达蛋白的基础。本专利技术还提供了上述引物组在构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因中的应用。进一步限定，构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因的具体步骤如下：S1：从弱毒性疫苗中提取RNA；S2：RNA进行PCR扩增反应；S3：纯化得到上述VP2、VP6以及VP7各自的基因。本专利技术还提供了上述所构建的VP2基因、VP6基因以及VP7基因在构建同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒中的应用。进一步限定，构建在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒中的应用，具体步骤如下：H1：利用VP2、VP6以及VP7各自的基因与载体连接且转化得到各自的重组质粒；H2：重组质粒的提纯；H3：重组质粒的酶切反应得到VP2、VP6以及VP7各自的基因片段；H4：VP2、VP6以及VP7各自的基因片段与带有相同粘性末端的载体连接并转化第一感受态细菌；H5：第一感受态细菌的鉴定结果为阳性则为VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒；H6：将VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒转化第二感受态细菌，提取PCR鉴定为阳性的各自的重组质粒；H7：将鉴定为阳性的各自的重组质粒转染对数生长期的细胞，得到各自的第一代重组杆状病毒样颗粒；H8：各自的第一代重组杆状病毒样颗粒分别进行传代培养且培养完成后转染对数生长期的细胞且传代培养至第三代，收集各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒；H9：利用各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒共感染对数期的细胞，得到同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒。进一步限定，所述第二感受态细菌中含有杆状病毒穿梭载体和具有编码转座酶和四环素抗性基因的辅助质粒。进一步限定，所述第一感受态细菌为DH5α感受态细菌。本专利技术还公开了上述所构建的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒在预防非细菌性腹泻中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组，其特征在于，包括第一引物、第二引物以及第三引物；/n其中第一引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；/n第二引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，第二引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；/n第三引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，第三引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括第一引物、第二引物以及第三引物；
其中第一引物的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，第一引物的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
第二引物的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，第二引物的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
第三引物的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，第三引物的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。


2.如权利要求1所述的引物组在构建G5型猪轮状病毒的VP2基因、VP6基因以及VP7基因中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因的具体步骤如下：
S1：从弱毒性疫苗中提取RNA；
S2：RNA进行PCR扩增反应；
S3：纯化得到上述VP2、VP6以及VP7各自的基因。


4.如权利要求3所述的应用中所构建的构建G5型猪轮状病毒的VP2基因、VP6基因以及VP7基因在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，构建同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒的具体步骤如下：
H1：利用VP2、VP6以及VP7各自的基因与载体连接且转化得到各自的重组质粒；
H2：重组质粒的提纯；
H3：重组质粒的酶切反应得到VP2、VP6以...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鑫，张兰，付雪，李豪，王红宁，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51