本发明专利技术在专利CN103667476A的基础上公开了转基因水稻mfb‑MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列。本发明专利技术通过hiTAIL‑PCR和LA‑PCR扩增的方法获得外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明专利技术进一步公开了外源插入片段全序列，其核苷酸为SEQ ID No.2所示；本发明专利技术提供的分子特征为转基因水稻mfb‑MH3301及其衍生品种检测方法的建立提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列
本专利技术涉及转基因水稻的侧翼序列，尤其涉及转基因水稻及其旁侧序列，属于转基因水稻分子特征检测领域。
技术介绍
自从1996年第一个转基因产品获得批准，转基因技术的应用呈指数增加，转基因作物进入市场的数量持续增长。国际农业生物技术组织(ISAAA)报道，2014年28个种植生物技术作物国家的种植面积达1.815亿公顷。随着转基因技术在发展和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，并申请商业化种植。转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。确定转基因生物的外源插入片段全序列、插入位点、旁侧序列等信息，可以为转基因生物的安全评价提供分子特征方面的依据，也是转化体之间进行比较研究，定性定量检测方法建立的基础。
技术实现思路
专利技术的目的之一是是获取转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列；本专利技术的目的之二获取转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段全序列；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：根据专利CN103667476A中提供的序列信息，外源插入片段位于水稻9号染色体上，在此段染色体序列上设计嵌套特异引物，利用hiTAIL-PCR和LA-PCR的方法向5’端未知序列步移；以专利CN103667476A中提供的序列信息，在序列末端设计嵌套特异引物，利用hiTAIL-PCR和LA-PCR的方法向3’端未知序列步移；最终两个方向获得的序列重叠，得到3’端旁侧序列及外源插入片段全序列；利用LA-PCR扩增技术，进一步验证外源插入片段及其在染色体上位置的正确性。附图说明图13’端hiTAIL-PCR扩增结果：1，3，5，7，为第二轮扩增产物；2，4，6，8为第三轮扩增产物。图23’端旁侧序列验证扩增结果：1、mfb-MH3301；2、明恢86。图3长片段扩增验证结果：1，3，5、明恢86；2，4，6、mfb-MH3301。具体实施方式实施例1转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列的获得一、实验材料1、植物材料：转基因水稻mfb-MH3301，明恢862、酶与试剂Takara的ExTaqTMVersion2.0plusdye和LATaqTMVersion2.0plusdye，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物由上海生工合成，BIOWEST公司的琼脂糖。3、实验仪器分光光度计：ThermoND-1000；离心机：ThermoBiogugePrimoR；PCR仪：ABIVeriti；凝胶成像仪：BioRadT2A；其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。二、实验方法1.水稻DNA提取与检测采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化，提取方法如下：1)取200mg水稻粉末样品；2)加入800μL65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。9)重复步骤8。10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。2.3’端旁侧序列的扩增根据专利CN103667476A中提供的序列信息，得到5’端旁侧序列2000bp，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第9号染色体(GeneBankID:NC-008402.2)的7709771-7710270位，其核苷酸序列与1-500位的核苷酸序列完全相同，因而在7710270位之后的核苷酸序列上设计嵌套特异引物，与简并引物进行三轮扩增，引物序列见表1。表13’端旁侧序列的获得所用引物表2hiTAIL-PCR反应体系表3hiTAIL-PCR扩增程序3.PCR产物测定第二轮和第三轮PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，挑选适合的第三轮PCR扩增产物用于序列测定。4.3’端旁侧序列验证在上述PCR产物测序结果上设计上游引物，在水稻第9号染色体7710270位之后的核苷酸序列上设计下游引物，进行PCR扩增并测序。PCR反应体系为：总体积为25.0μL，其中，ExTaqMix缓冲液12.5μL，10μmol/L的上下游引物各1μL，25ng/μLDNA模板2μL，用去离子水补至25μL。PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃延伸7min。电泳图见附图2。3和4测序结果拼接构成完整的3’端旁侧序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。实施例2转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段全序列的获得一、实验材料同实施例1二、实验方法1.水稻DNA提取与检测同实施例12.外源插入片段全序列的扩增根据专利CN103667476A中提供的转化载体pCDMARUBb-Hyg的T-DNA区域结构示意图，进行构建特异性实验，测序，并与已知序列进行拼接，得到5’-3’端部分序列，绘制构建线性如下，所用引物序列见表4。表4构建特异性实验所用引物在此拼接序列的基础上和本专利中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列设计嵌套特异引物，结合简并引物，从两个方向进行多次hiTAIL-PCR和LA-PCR扩增，最终两个方向获得的序列重叠，得到外源插入片段全序列，所用引物序列见表5。LA-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNo.2所示。
3.制备权利要求1外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列及权利要求2所述的外源插入片段全序列的方法，是在专利CN103667476A的基础上，以转基因水稻mfb-MH3301基因组DNA为模板，通过hiTAIL-PCR和LA-PCR的方法扩增得到的。
4.根据权利要求3所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗朝华，董美，高进，宛煜嵩，刘卫晓，王迪，梅英婷，王锋，金芜军，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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