经修饰的人促红细胞生成素制造技术

本发明专利技术涉及经修饰的人促红细胞生成素，其具有增加的血浆半衰期并且具有相对天然促红细胞生成素小于0.5％的促红细胞生成活性，其维持了神经保护和神经重构能力并且通过掺入共有的N‑糖基化位点而包括同二聚体或异二聚体受体的至少一个结合位点的突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的人促红细胞生成素
本专利技术描述了具有神经重构(neuroplastic)和神经保护(neuroprotective)能力的经修饰的促红细胞生成素分子，其可用于治疗中枢神经系统疾病，例如脑血管意外、神经创伤、神经炎症和神经退化。现有技术促红细胞生成素(EPO)是I型细胞因子超家族的一部分，其特征在于具有重要的多效活性[1]。该细胞因子是红细胞生成的主要调节剂之一，与其他分子协同作用以促进红系谱系细胞祖细胞的增殖、分化和存活，并维持大部分循环红细胞[2]。人EPO(hEPO)是高度糖基化的蛋白，其分子量范围为30至39kDa。它具有三个共有的N-糖基化位点和一个O-糖基化位点[3]，它们可能以总的占用率发生。糖链由可变的单糖序列和可变数量的唾液酸(SA)组成[4,5]。N-连接的碳水化合物可包含两个、三个或四个支链，每个支链以带负电荷的SA分子结尾。就其本身而言，在O-糖基化位点结合的碳水化合物可包含至多两个SA分子[6]。糖基化，尤其是N-聚糖的SA末端，对于EPO的体内生物学活性至关重要，但对于体外受体结合并非如此[7,8]。这就是为什么糖苷含量较低的EPO分子对EPO受体(EPOR)具有高亲和力的原因；然而，它们的体内活性随着血浆清除率的增加而降低[8]。这些细胞因子的糖基化程度影响其产生效率、与受体的亲和力、血浆半衰期、分泌和蛋白稳定性[5,9]。自1985年克隆hEPO基因以来，有关细胞因子生物学的知识已发生了巨大变化。最早的进展之一是发现了该分子的一种新的生物学作用，这种作用扩展了其促红细胞生成能力，并包括几个重要的生理过程。其中一些最重要的是血管生成、血管阻力调节以及(更重要的是)细胞保护[10,11]。尽管促红细胞生成素最重要的活性是造血作用，但在各种组织和非促红细胞中EPO及其受体的存在证实了上述的假说，即EPO具有多种功能，并且其中最重要的一种是对中枢神经系统、心脏、肾脏、胃肠系统、生殖道和内皮细胞的细胞保护功能[12]，促进细胞增殖、血管生成并抑制细胞凋亡[13]。这些发现扩展了临床治疗其他疾病如心脏病发作、脑血管发作和许多其他与神经保护有关的疾病的预期[14]。神经保护可以定义为维持和恢复大脑中细胞相互作用，从而最大程度地保护神经元功能的一种方法[15]。神经保护的目的是防止中枢神经系统疾病的病理性神经元丢失，例如脑血管意外、神经创伤、神经炎症和神经退化。神经退行性疾病是一系列影响神经系统，导致认知障碍、行为障碍和机体调节系统变化的病理。它们的特点是长期性和渐进性。这些疾病包括帕金森氏病、不同类型的痴呆症、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和亨廷顿氏病(Huntington)等疾病，除了其他之外，从医学、医疗保健、社会和经济的角度来看，这是所有国家都必须面对的问题[16]。但是，随着世界人口的老龄化，无论是发达国家还是发展中国家，神经系统疾病的影响都会更大。在65岁以上人口比例增加的国家中，神经系统疾病的负担正在达到相当大的比例。仅考虑阿尔茨海默氏病，统计数据表明，全世界约有4400万人患有痴呆症，这一数字估计到2050年将增至1.15亿。这就是为什么这种疾病被认为是一种全球流行病的原因[17-19]。因此，世界各地许多研究小组都在寻找能够控制这种神经退行性疾病的治疗方法。许多研究小组的共同努力使得研究进展为问题的根源带来了新的曙光，给早期发现带来了希望，并明确了更具体的攻击方法。但是，即使这样的努力，也没有发现任何可以治愈这种疾病的生物疗法。从这个意义上讲，制药市场仅提供了在发现这些疾病后延缓其进展的药物，但是这些药物的益处通常难以察觉，这就是为什么有必要开发新疗法的原因。今天，解决神经退行性疾病所带来的健康问题的成功，除其他方面外，将依赖于开发通过有利地影响病因或潜在发病机制以及以安全、成功和有效的方式预防或延缓疾病的发作或临床上的逐渐恶化而产生益处和持久作用的疗法。但是，反过来，有必要提出一种使大量人群皆可使用的有效的技术。近年来，制药行业的主要目标是找到能够攻击许多中枢神经系统疾病发展过程中的共同关键点(例如细胞凋亡、氧化应激、炎症、代谢功能障碍或受损的神经重构性)的化合物。在这个研究领域中，EPO由于在大脑中产生直接与细胞损伤的保护和修复有关的广泛的细胞应答的能力，而起着非常重要的作用[20]。EPO可通过抗炎、抗氧化、抗神经毒性、血管生成、神经营养、再生和抗凋亡机制来诱导神经保护。鉴于此，在EPO研究中的另一个极其重要的进展是，鉴定了与它们的促红细胞生成和细胞保护性生物学活性有关的两个不同的分子位点。这两种活性是通过细胞因子与两种不同受体系统(负责促红细胞生成活性的同二聚体受体(EPOR)2和涉及细胞保护活性的异二聚体受体EPOR-βCR)的结合而产生的[21]。这些发现非常重要，因为它们提供了了解EPO形成其生物学活性的途径的必要信息，由此可以选择性调节其促红细胞生成或细胞保护应答，避免或至少减少与使用非选择性药剂(例如EPO或EPO类似物)相关的副作用。从这个意义上讲，尽管EPO被认为是治疗贫血的安全且耐受性良好的药物，但是当EPO打算用作脑血管发作或心脏病发作的患者的细胞保护剂时，即作为不患有贫血的患者的神经保护剂时，其血液学作用应视为副作用，因为它会导致红细胞增多症、高血压和血栓形成现象[22-25]。这就是为什么选择性调节其促红细胞生成作用和细胞保护作用的EPO类似物的开发具有重要意义[14]。为了这个目的，已经设计了各种策略，以通过对分子进行化学修饰或调控糖苷含量，来废除细胞因子的促红细胞生成活性并维持其神经保护潜力。关于在EPO分子上进行化学修饰的策略，已经评估了七个赖氨酸残基的氨甲酰化作用，产生了高瓜氨酸残基[26]。但是，这种方法会在蛋白质中产生影响其功能的构象变化。基于这些结果，不同的工作组已通过氨基甲酰化作用完全修饰了重组hEPO(rhEPO)，获得了一种新分子，称为CEPO，该分子保留了其细胞保护活性，而缺乏促红细胞生成活性[26-28]。然而，需要高量和多个剂量以达到所需目的并维持其治疗功效。另一方面，已经通过控制rhEPO的唾液酸(SA)含量对其进行了修饰。2003年，Erbayraktar等人完全消除了EPO糖苷链末端存在的SA残基，从而产生了所谓的AsialoEPO[29]。这种新的EPO变体显示出高的体外活性。然而，其体内神经保护活性与用rhEPO所获得的神经保护活性相当。另一方面，为了增加刺激红细胞生成的细胞因子的循环半衰期，Egrie和Brown开发了一种刺激红细胞生成的蛋白：NESP，它是从hEPO衍生而来，并具有两个额外的N-糖基化位点[6]。这种修饰导致血浆半衰期增加三倍及其体内造血效力。关于糖苷含量的调控，本申请的专利技术人已经获得了具有与脑EPO(rhNEPO)相似的特征的rhEPO变体，其是较少的rhEPO酸性同功型(isoform)的组合。该变体表现出与rhEPO相当的神经保护活性，并表现出小于4％的造血活性[30]。但是，当将rhNEPO分子提议用作治疗要求本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰的人促红细胞生成素，其具有相对天然促红细胞生成素小于0.5％的促红细胞生成活性并且维持了其神经保护和神经重构能力，其特征在于，通过添加共有的糖基化位点，所述经修饰的人促红细胞生成素包含与同二聚体或异二聚体受体结合的结合位点的至少一个突变。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180927 AR 201801027931.一种经修饰的人促红细胞生成素，其具有相对天然促红细胞生成素小于0.5％的促红细胞生成活性并且维持了其神经保护和神经重构能力，其特征在于，通过添加共有的糖基化位点，所述经修饰的人促红细胞生成素包含与同二聚体或异二聚体受体结合的结合位点的至少一个突变。


2.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其中与受体结合的所述结合位点选自包括以下位置的氨基酸组：45-47、15-17、104、98-100、106-108、149、151-153、76-78、72-74、62-64、65-67、及其组合。


3.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其特征在于，所述突变选自包括以下的组：
a.Lys45Asn和Asn47Thr；
b.Tyr15Asn和Leu17Thr；
c.Ser104Asn；
d.Ala98Asn和Ser100Thr；
e.Thr106Asn和Leu108Thr；
f.Leu149Thr；
g.Gly151Asn和Leu153Thr；
h.Arg76Asn和Gln78Thr；
i.Glu72Asn和Val74Thr；
j·Glu62Asn和Trp64Thr；和
k.Gln65Asn和Leu67Thr。


4.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其特征在于，其具有相对人促红细胞生成素至多0.2％的促红细胞生成活性。


5.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其特征在于，其不具有促红细胞生成活性。


6.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其特征在于，其由包含选自包括以下的组的核苷酸序列的DNA序列编码：SEQIDN°1、SEQIDN°3、SEQIDN°7、SEQIDN°9、SEQIDN°11、SEQIDN°13、SEQIDN°15、SEQIDN°17、SEQIDN°19、SEQIDN°21和SEQIDN°23。


7.如权利要求1所述的经修饰的人促红细胞生成素，其特征在于，其包含选自包括以下的组的氨基酸序列：SEQIDN°2、SEQIDN°4、SEQIDN°8、SEQIDN°10、SEQIDN°12、SEQIDN°14、SEQIDN°16、SEQIDN°18、SEQIDN°20、SEQIDN°22和SEQIDN°24。


8.一种核酸，其至少包含选自包括以下的组的核苷酸序列：SEQIDN°1、SEQIDN°3、SEQIDN°7、SEQIDN°9、SEQIDN°11、SEQIDN°13、SEQIDN°15、SEQIDN°17、SEQIDN°19、SEQIDN°21和SEQIDN°23。


9.一种转化载体，其特征在于，其包含选自包括以下的组的核苷酸序列：SEQIDN°1、SEQIDN°3、SEQIDN°7、SEQIDN°9、SEQIDN°11、SEQIDN°13、SEQIDN°15、SEQIDN°17、SEQIDN°19、SEQIDN°21和SEQIDN°23。


10.一种表达载体，其特征在于，其包含选自包括以下的组的核苷酸序列：SEQIDN°1、SEQIDN°3、SEQIDN°7、SEQIDN°9、SEQIDN°11、SEQIDN°13、SEQIDN°15、SEQIDN°17、SEQIDN°19、SEQIDN°21和SEQIDN°23。


11.一种慢病毒载体，其特征在于，其包含选自包括以下的组的核苷酸序列：SEQIDN°1、SEQIDN°3、SEQIDN°7、SEQIDN°9、SEQIDN°11、SEQIDN°13、SEQIDN°15、SEQIDN°17、SEQIDN°19、SEQIDN°21和SEQIDN°23。


12.一种经遗传修饰的细胞，其包含选自包括以下的组的核酸分子：SEQIDN°1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：马科斯·奥盖罗埃伯哈特，玛丽亚·德洛斯·米拉格罗斯·布尔吉菲索洛，阿奎尔斯·多雷拉，加芙列拉·I·阿帕里西奥，玛丽娜·埃切韦里加雷，卡米拉·斯科蒂卡蒂，里卡多·克拉特耶，
申请(专利权)人：利托瑞尔国立大学，国家科学和技术研究委员会CONICET，圣马丁国立大学，
类型：发明
国别省市：阿根廷;AR