一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。所述试剂盒包括乳胶凝集颗粒、阳性对照品和阴性对照品；所述乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。该试剂盒可实现快速检测舒伯特气单胞菌抗体，对该病的流行病学调查及防控有重要意义；利用该试剂盒进行检测，反应时间短，操作简便，在临床快速诊断领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及鱼类免疫检测
，具体涉及一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
舒伯特气单胞菌(A.schubertii)气单胞菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性、人-畜-鱼共患的条件下致病菌。舒伯特气单胞菌在5％绵羊血琼脂平板上呈灰白色菌落，直径为0.8-2.2mm，近圆形，光滑湿润，中部略微凸起，边缘整齐，β-溶血；LB肉汤培养基中舒伯特气单胞菌生长均匀浑浊，长时间培养后有絮状沉淀产生，可形成一层较厚的一摇即破的菌膜，其对甘露醇、蔗糖、吲哚表现为阴性，氧化酶、接触酶为阳性。2009年6月到8月，舒伯特气单胞菌在我国湖北咸宁市乌鳢养殖池塘爆发，造成养殖乌鳢死亡，随后在广州、佛山等地患病杂交鳢体内检出舒伯特气单胞菌，通过回归实验发现，该菌株可以引起鳢科鱼类内脏(肝、脾、肾)出现明显的、柔软、平滑、边缘整齐的白色结节，结节呈现白色点状坏死、界限不明显，且形成时间短。取结节涂片镜检发现白点内含有大量革兰氏阴性短杆菌。舒伯特气单胞菌发病急，发病快，造成的随时巨大，是鳢科鱼类的主要病原菌，但是对其研究较少，缺少相应的抗体的检测手段。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，该试剂盒能够实现舒伯特气单胞菌抗体的快速检测，对该病的流行病学调查及防控具有重要意义。本专利技术还提出一种上述试剂盒的制备方法。本专利技术还提出上述试剂盒的应用。根据本专利技术的第一方面实施方式的试剂盒，所述试剂盒包括乳胶凝集颗粒、阳性对照品和阴性对照品；所述乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。根据本专利技术实施方式的检测试剂盒，至少具有如下有益效果：该试剂盒可实现快速检测舒伯特气单胞菌抗体，对该病的流行病学调查及防控有重要意义；利用该试剂盒进行检测，反应时间短，操作简便，在临床快速诊断领域具有广阔的应用前景。根据本专利技术的一些实施方式，所述阳性对照品为舒伯特气单胞菌免疫的鱼血清。根据本专利技术的一些实施方式，所述阴性对照品为未免疫的鱼血清。根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂盒还包括多孔板；优选地，所述多孔板为96孔板。根据本专利技术的一些实施方式，所述多孔板选自V孔板、U孔板或平底板中的至少一种。配制多孔板，以便于实现高通量快速检测，可在每个孔中加入不同量的待测样品，然后用排枪向每孔中加入相应体积的致敏乳胶，再将反应板置于振荡器中，震荡混匀，提升检测效率。根据本专利技术第二方面实施方式的制备方法，包括乳胶凝集颗粒的制备步骤，具体包括：S1、制备破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白：取舒伯特气单胞菌全菌进行破碎处理，得所述菌体蛋白；S2、制备乳胶凝集颗粒：取聚苯乙烯乳胶溶液与步骤S1制得的所述菌体蛋白发生致敏反应后，用质量浓度大于0.01％的封闭剂封闭，即得所述乳胶凝集颗粒。根据本专利技术实施方式的制备方法，至少具有如下有益效果：本专利技术方案利用封闭剂对致敏后的乳胶颗粒进行封闭，使得制得的乳胶凝集颗粒的检测结果更准确可靠，实现水产养殖领域的临床样品快速检测，进而用于指导临床用药。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2还包括对聚苯乙烯乳胶进行预处理的步骤。根据本专利技术的一些实施方式，所述预处理包括取含有聚苯乙烯的乳胶溶液与胰蛋白酶溶液混合并用缓冲液I稀释，反应后，收集上清液，重悬，即得。根据本专利技术的一些实施方式，上述反应是置于25℃～45℃(优选为37℃)下进行的。用胰蛋白酶进行预处理，胰蛋白酶的处理是消化杂蛋白，避免出现非特异性凝集。根据本专利技术的一些实施方式，所述缓冲液I为甘氨酸盐缓冲液I，所述甘氨酸盐缓冲液I的pH约为8.6，甘氨酸盐的浓度约为0.5mol/L。根据本专利技术的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液I的制备方法如下：按每升溶液中含甘氨酸约186.7mmol、氢氧化钠约17.5mmol、氯化钠约290.6mmol、防腐剂(优选为叠氮化钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin防腐剂中的至少一种)约15.4mmol的量称取制备原料，调控pH约为8.6，加水定容，即得。根据本专利技术的一些实施方式，所述含有聚苯乙烯的乳胶溶液中聚苯乙烯的质量浓度为8％～12％(优选为9％～11％；更优选为10％)。根据本专利技术的一些实施方式，所述聚苯乙烯乳胶溶液中聚苯乙烯的质量浓度为1.5～2.5％(优选为1.9％～2.1％；更优选为2％)。根据本专利技术的一些实施方式，所述聚苯乙烯与胰蛋白酶的质量比例为(0.9～1.1):(0.9～1.1)；优选为1:1。根据本专利技术的一些实施方式，所述胰蛋白酶溶液的制备步骤为取胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解得到。根据本专利技术的一些实施方式，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量浓度为8％～12％；优选为9％～11％；更优选为10％。根据本专利技术的一些实施方式，所述PBS的pH约为7.4。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中致敏反应过程中，菌体蛋白浓度为0.001mg/L～1mg/L。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中致敏反应的温度为20℃～60℃；优选为25℃～50℃；更优选为25℃～45℃；进一步更优选为30℃～40℃；最优选为37℃。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中致敏反应的时间为0.5h～4h；优选为0.75h～2.5h；更优选为1h～2h。根据本专利技术的一些实施方式，所述封闭剂选自牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉(优选地质量百分数约为5％)、酪蛋白、明胶和Tween-20(优选地质量百分数为0.05～0.1％)中的至少一种。根据本专利技术的一些实施方式，所述封闭剂的质量浓度为0.1％以上；优选为0.1％～3％；更优选为1％～2％。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1具体为取舒伯特气单胞菌，用甘氨酸盐缓冲液II重悬洗涤后，超声破碎后，制得所述菌体蛋白。根据本专利技术的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液II的pH约为8.2，甘氨酸盐的浓度约为0.05mol/L。根据本专利技术的一些实施方式，所述甘氨酸盐缓冲液II的制备方法为取甘氨酸盐缓冲液I稀释后得到。通过优化乳胶凝集颗粒制备过程中致敏时间、温度及封闭剂的浓度、封闭时间、温度等参数显著提升了致敏乳胶试剂的敏感性和稳定性。根据本专利技术的一些实施方式，所述制备方法还包括通过常规方法制备阳性及阴性对照品。根据本专利技术第三方面实施方式上述试剂盒在检测舒伯特气单胞菌抗体分泌功能的产品中的制备中的应用。根据本专利技术实施方式的应用，至少具有如下有益效果：该试剂盒使用操作简便，适合临床样品快速检测，其检测结果对鱼类诺卡氏菌病防治具有重要指导意义。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括乳胶凝集颗粒、阳性对照品和阴性对照品；所述乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括乳胶凝集颗粒、阳性对照品和阴性对照品；所述乳胶凝集颗粒为破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白致敏聚苯乙烯乳胶颗粒。


2.根据权利要求1所述的舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为舒伯特气单胞菌免疫的鱼血清。


3.根据权利要求1所述的舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为未免疫的鱼血清。


4.根据权利要求1所述的舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括多孔板；优选地，所述多孔板为96孔板；优选地，所述多孔板选自V孔板、U孔板或平底板中的至少一种。


5.根据权利要求1至4任一项所述的舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括乳胶凝集颗粒的制备步骤，具体包括：
S1、制备破碎舒伯特气单胞菌的菌体蛋白：取舒伯特气单胞菌全菌进行破碎处理，得所述菌体蛋白；
S2、制备乳胶凝集颗粒：取聚苯乙烯乳胶溶液与...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小琴，王洲，陈善真，刘文娜，李中圣，谭晓晨，刘晓云，李珊，黄锦炉，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44