一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞制备及其应用，将修饰有生物正交反应基团的非天然糖添加到免疫细胞如NK细胞的培养基中，以获得修饰有生物正交反应基团的免疫细胞；然后将一端为可与上述生物正交反应基团匹配产生连接反应的生物正交反应配对基团的靶向配基如纳米抗体在生理条件下通过生物正交反应修饰到免疫细胞表面，连接方式为转肽酶SrtA介导的化学酶法，靶向配基具有高特异性识别并结合到肿瘤细胞表面高表达受体的特性。本发明专利技术公开的靶向配基修饰的免疫细胞可特异性的靶向结合于癌细胞，进而修饰后的免疫细胞产生分泌大量的细胞因子使癌细胞表面发生穿膜孔洞或吞噬裂解癌细胞的效应，具有特异性杀伤癌细胞的作用。有特异性杀伤癌细胞的作用。有特异性杀伤癌细胞的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物医药工程
，具体涉及一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]癌症依然是威胁人类健康的头号杀手，是导致人类死亡的第二大因素。据全球医官网报道：预计2020年，全球新发癌症病例1890万例，死亡病例968万例，其中我国新增病例预计将达到385.4万例、死亡病例249.6万例，占据了癌症发病人数、死亡人数全球双榜首。
[0003]癌症的免疫治疗方法被誉为癌症治疗的第三次革命，是现今研究最为火热的治疗方式。过继细胞疗法是免疫治疗常见的手段，其中最具代表性的是将免疫细胞进行体外修饰后回输到患者体内进行治疗，这其中包括自体和异体细胞输送。免疫细胞包括自然杀伤性细胞(natural killer cell；NK细胞)、T细胞、巨噬细胞等，尤其是NK细胞是先天免疫系统中最具重要的免疫细胞，它们不依赖于特异性抗原刺激而具有天然的抗肿瘤和抗感染能力。NK细胞在循环中的寿命较短，不会像基于T细胞的免疫疗法中常见的危险细胞因子风暴。但是NK细胞要发挥其功能，需要与肿瘤细胞密切接触。NK细胞与靶细胞结合后，分泌释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒性颗粒，并在不受主要组织相容性复合物限制下表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，从而诱导肿瘤细胞表面发生穿孔裂解死亡。
[0004]尽管NK细胞、T细胞等免疫细胞有着较好的肿瘤杀伤活性，但是它们缺乏靶向结合于肿瘤细胞的能力，另外尤其是许多肿瘤细胞已进化出了免疫逃逸机制，这给肿瘤的治疗造成了麻烦。
[0005]为了解决这一问题，基于嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)技术，修饰免疫细胞用于肿瘤的治疗受到了广大研究者的关注，其中最具代表性的Kymriah和Yescarta两款CAR
‑
T细胞已被美国FDA在2017年批准用于临床。鉴于此，广大研究工作者考虑将CAR技术用于NK细胞的工程化，尽管目前尚无CAR
‑
NK细胞产品上市，但是通过检索clinicaltrials.gov网站，关于CAR
‑
NK的相关临床研究至少有19项之多，都在不同程度上进入了临床1/2期，治疗的肿瘤涵盖了实体瘤、血液瘤以及淋巴瘤。近期关于CAR修饰的巨噬细胞CAR
‑
M也有了研究报道。CAR技术修饰的靶向配基一般为单链抗体(single
‑
chain variable Fragment；scFv)，但是这样的片段抗体亲和力低、稳定性差，使得scFv
‑
CAR
‑
NK细胞的应用受到了一定限制。另外在前期的报道中也有报道利用适配体、靶向肽对免疫细胞进行修饰，但是适配体作为单链寡核苷酸，在体内环境中易受到核酸酶的攻击，很容易降解而失去其活性；而靶向肽是一类只有几十个氨基酸残基的多肽，其结构简单，在体内多细胞环境中识别和结合癌细胞上受体的能力有限。
[0006]靶向配基，是能特异性识别并结合肿瘤细胞表面高表达受体的生物大分子，其中包括纳米抗体、适配体、scFv、糖配体、靶向肽等。纳米抗体(Nanobody，Nb)是天然存在于骆驼科及鲨鱼科血清中的一种抗体，分子量约为15kDa左右(分子量是scFv的一半)，是现今已
知的最小抗体，其基因由人VH家族的III型亚族进化而来，两者具有高度的同源性，但是纳米抗体的CDR3区比人抗体CDR3区要多4～9个氨基酸残基，使得纳米抗体可形成一个特殊的凸环结构，能识别更加隐蔽的抗原决定簇。另外纳米抗体中的FR2区有四个疏水性氨基酸突变为了亲水性氨基酸，大大增加了纳米抗体的水溶性，同时纳米抗体内部的二硫键使其抗热性以及耐酸碱性都大大增强。若将纳米抗体这类靶向配基对NK细胞乃至其他免疫细胞进行修饰，则会显著提高免疫细胞的靶向性，进而产生较佳的肿瘤治疗效果。
[0007]2020年年初，已有第一篇关于纳米抗体修饰NK的报道(doi:10.3390/cells9020321)，作者借助CAR技术，将纳米抗体修饰到原代NK细胞(分离于人外周血)，获得了很好的抗肿瘤活性Nb
‑
CAR
‑
NK细胞。但是CAR技术的实施，需要慢病毒等逆转录病毒的介导，将外源质粒导入NK细胞中，这样的遗传操作会产生病毒基因插入人体正常细胞基因组的风险，具有一定的安全隐患。另外原代NK细胞的分离、扩增耗时耗力。因此，开发一种便捷、安全、行之有效的抗肿瘤NK细胞意义重大。
[0008]近些年，发展了一种代谢糖工程与点击化学反应相结合的化学生物学新技术，利用该技术可对许多细胞进行特定的修饰，许多文献报道该技术的一般过程为先将叠氮糖经细胞摄取，使细胞携带叠氮基团，然后将偶连有炔基(如DBCO或端炔基)的适配体、化学药物或荧光基团通过无铜催化或铜催化使细胞连接上特定基团，在上述炔基的修饰过程中均通过纯化学合成，但是由于纯化学合成都需要用到大量有机试剂作为溶剂，使得炔基在修饰纳米抗体、单链抗体以及传统抗体等蛋白类物质时不适用上述方法，因此需要借助更加高效、更加温和的酶方法进行连接。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞的制备方法及应用，尤其是一种基于纳米抗体细胞偶联技术的抗肿瘤NK细胞的制备方法及应用，其中，所述的靶向配基细胞偶联技术在不涉及遗传操作的前提下，通过利用细胞自身的代谢途径、再结合一系列的化学酶法将包括纳米抗体在内的靶向配基共价装载到细胞表面，我们称之为靶向配基细胞偶联技术(Ligand
‑
targeted cell conjugate；LTCC)，使用纳米抗体作靶向配基时，该技术则可称作纳米抗体细胞偶联技术(nanobody
‑
cell conjugate；NBCC)。
[0010]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0011]一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，表面分别修饰有生物正交反应配对基团、生物正交反应基团的靶向配基、免疫细胞通过生物正交反应对应连接，形成表面偶联有具有特异性识别并结合癌细胞表面高表达受体的靶向配基的靶向免疫细胞，其中靶向配基为生物大分子。
[0012]进一步的，所述靶向配基为包括但不限于纳米抗体、适配体、单链抗体(scFv)、糖配体、靶向肽等在内的生物大分子。
[0013]进一步的，所述免疫细胞包括NK细胞、T细胞以及巨噬细胞，所述NK细胞包括但不限于NK92
‑
MI细胞系、NK92细胞系及从人体中分离得到的原代NK细胞等。
[0014]进一步的，所述生物正交反应配对基团为与非天然糖上的生物正交反应基团成对应用；所述生物正交反应基团包括叠氮基团、酮/醛基、烯烃基、环炔基等，对应的所述生物
正交反应配对基团即为含炔基化合物、羟胺、含四氮唑化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，其特征在于：表面修饰有生物正交反应基团的免疫细胞与表面修饰有生物正交反应配对基团的靶向配基通过生物正交反应对应连接，形成表面偶联有特异性识别并结合癌细胞表面高表达受体的靶向配基的靶向免疫细胞。2.根据权利要求1所述的基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，其特征在于：所述靶向配基为包括纳米抗体、适配体、单链抗体、糖配体、靶向肽在内的生物大分子。3.根据权利要求1所述的基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞，所述NK细胞包括但不限于NK92
‑
MI细胞系、NK92细胞系及从人体中分离得到的原代NK细胞。4.根据权利要求1所述的基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，其特征在于：所述生物正交反应基团包括但不限于叠氮基团、酮/醛基、烯烃基、环炔基；所述生物正交反应配对基团为与非天然糖上的生物正交反应基团成对应用，对应的所述生物正交反应配对基团即为含炔基化合物、羟胺、含四氮唑化合物、含四嗪化合物，所述含炔基化合物包括但不限于用于无铜催化的二苯并环辛炔DBCO、二氟化环辛炔DIFO、双芳基环辛炔酮BERAC和用于铜催化的末端为炔基的化合物。5.根据权利要求4所述的基于靶向配基细胞偶联技术的抗肿瘤免疫细胞，其特征在于：所述非天然糖包括但不限于N
‑
叠氮乙酰基乙酰化甘露糖胺Ac4ManNAz、N
‑
叠氮乙酰基乙酰化半乳糖胺Ac4GalNAz、N
‑
叠氮乙酰基乙酰化葡萄糖胺Ac4GlcNAz、N
‑
叠氮乙酰基乙酰化甘露糖胺ManNAz、N
‑
叠氮乙酰基乙酰化唾液酸SiaNAz、N
‑
丙酰基乙酰化甘露糖胺ManLev、N
‑
丙酰基乙酰化甘露糖胺Ac4ManLev。6.一种基于靶向配基细胞偶联技...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄朝晖，吴志猛，龚亮，李艳春，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：