抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用制造技术

本发明专利技术提出一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供的抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物，该抗菌脂肽Fengycin来源于海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的发酵提取物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。此外，本发明专利技术还对海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的发酵培养基进行了优化，利用优化后的发酵培养基产生的抗菌脂肽含量为(571.26

【技术实现步骤摘要】
抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素是一类聚酮衍生的呋喃氧杂萘邻酮物，属于曲霉的次生代谢产物，目前已证实能产生黄曲霉毒素的菌株主要是曲霉属的黄曲霉和寄生曲霉。大量的实验数据表明，黄曲霉毒素可使人类和多种动物诱发实验性肝癌，是目前已发现的最强化学致癌物。黄曲霉毒素的去除方法可分为常规方法和生物脱毒法，常规方法包括碱处理法、氧化处理法、吸附剂处理法等，但常规方法容易导致营养损失，并且成本较高；生物脱毒法具有特异性强、不对原料产生污染等优点，是近些年黄曲霉毒素脱毒研究的热点。尤其是花生等农作物上的黄曲霉毒素更是非常棘手的农产品安全问题。
[0003]海洋微生物种类繁多、代谢产物丰富多样而有别于陆生生物，从中筛选出既可以抑制黄曲霉生长，又不会对花生等农作物产生二次污染，即安全无毒的抗黄曲霉微生物或功能因子，具有很大的开发潜力和研究价值。目前，国内外对抗菌海洋微生物和抗菌海洋活性物质的研究很多，主要分布在交替单胞菌属(Alteromonassp.)、节杆菌属(Arthobactersp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、假单胞菌属 (Pseudomonassp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)、葡萄球菌属 (Staphylococcussp.)等菌属，这些海洋微生物或其代谢产物对一些病原细菌和某些植物病原真菌都有较好地抑制作用，但目前有关海洋微生物作为抗黄曲霉活性来源的研究鲜有报道，也没有有关海洋微生物抑制黄曲霉生长和毒素合成的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种抗菌脂肽Fengycin，其来源于海洋巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium的发酵提取物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，所述抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物。
[0006]作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin A具有结构式(I)，抗菌脂肽Fengycin B具有结构式(II)：
[0007][0008]其中，R1是含有15
‑
18个碳的脂肪酸链，R2是含有15
‑
16个碳的脂肪酸链。
[0009]作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin中抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽 Fengycin B的质量比为1：1。
[0010]作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin是通过海洋巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium发酵培养得到的发酵液先经酸沉淀法得到抗菌脂肽的粗提脂肽、再对粗提脂肽进行分离纯化得到，其中，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium于2013年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7086。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0011]作为优选，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium具有如SEQ IDNO.1所示序列。
[0012]作为优选，所述发酵培养所采用的发酵培养基为MgSO
4 0.78g/L、酵母浸膏0.05g/L、KH2PO
4 1.50g/L和CuSO
4 0.39mg/L。
[0013]作为优选，对粗提物进行分离纯化得到具体为：
[0014]采用超滤膜分离装置先截留粗提脂肽水溶液中分子量超过30kDa的大分子物质，收集截留物，利用Milli
‑
Q水溶解并加入色谱级甲醇使脂肽胶束分散成单体；
[0015]将上述处理过的溶液再次使用超滤膜分离装置将分子量小于30kDa的脂肽单体分子分离出去，收集过滤液，浓缩得到纯化的抗菌脂肽Fengycin。
[0016]作为优选，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时对黄曲霉具有良好的抑制作用，该浓度下，黄曲霉的抑菌圈直径高达20.7
±
0.2mm。
[0017]作为优选，抗菌脂肽Fengycin在50
±
0.1μg/mL浓度时，达到对黄曲霉菌孢子生长的最低抑菌浓度；在200
±
0.2μg/mL浓度时，达到完全没有黄曲霉菌孢子萌发的最低杀真菌浓度；在140μg/mL浓度时，能够抑制黄曲霉的产孢能力和菌丝延长；在400μg/mL时，不再观察到菌丝生长。
[0018]作为优选，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时，黄曲霉毒素的生物合成得以完全抑制。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
[0020]1、本专利技术采用滤纸片扩散法从海洋中分离筛选出1株抑制黄曲霉活性高的微生物，利用16S rDNA特异性扩增技术对其菌种进行鉴定，证明其为海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；
[0021]2、本专利技术对利用海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium产抗菌脂肽的发酵培养
基进行优化，利用回归方程得到抗菌脂肽产量最高时各关键因子的最优组合：MgSO
4 0.78g/L、酵母浸膏0.05g/L、KH2PO
4 1.50g/L和CuSO
4 0.39 mg/L。利用优化后的发酵培养基产生的抗菌脂肽含量为(571.26
±
9.72)mg/L，为优化前产量的1.82倍，这为产抑制黄曲霉的抗菌脂肽大规模生产奠定基础；
[0022]3、本专利技术对所得抗菌脂肽进行了分离，首次发现了抗菌脂肽Fengycin，其为抗菌脂肽FengycinA和抗菌脂肽Fengycin B的混合物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例提供的Fengycin(FengycinA和FengycinB混合物) 的液相色谱图；
[0024]图2为本专利技术实施例提供的对照组(左)和实验组(右)对黄曲霉的抑菌效果示意图；
[0025]图3为本专利技术实施例提供的扫描电镜观察Fengycin对黄曲霉菌菌丝形态的影响，其中，A、B为对照组菌丝体；C、D为处理组菌丝体；
[0026]图4为本专利技术实施例提供的扫描电镜观察Fengycin对黄曲霉菌孢子形态的影响，其中，A、B为对照组孢子形态；C、D为处理组孢子形态；
[0027]图5为本专利技术实施例提供的透射电镜观察Bacillo mycin D对黄曲霉菌菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin A具有结构式(I)，抗菌脂肽Fengycin B具有结构式(II)：其中，R1是含有15
‑
18个碳的脂肪酸链，R2是含有15
‑
16个碳的脂肪酸链。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin中抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的质量比为1：1。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin是通过海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium发酵培养得到的发酵液先经酸沉淀法得到抗菌脂肽的粗提脂肽、再对粗提脂肽进行分离纯化得到，其中，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium于2013年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7086。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium具有如SEQ ID NO.1所示序列。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养所采用的发酵培养基为MgSO
4 0.78g...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔青，牟海津，张芳，马云晓，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：