一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过单因素实验和正交实验，确定了酶解方格星虫的最佳工艺参数为复合酶粉(胰酶

【技术实现步骤摘要】
一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着我国经济的发展，人民的生活水平不断提升，我国高血压患病人数也在不断增加。据估测2020年我国高血压患者人数可能超过3亿人。现有降压药多是人工合成的化学药物，其在临床应用过程中易产生多种副作用，且生产成本较高。因此成本低廉、安全性高、降压效果好的生物降压肽成为了近年来的研究重点。
[0003]由于海洋生态环境的特殊性(如高压、低温等)，海洋生物源蛋白质具有多种特异性氨基酸的组成和序列以及低抗原性的特点，安全性高，无毒副作用。因此海洋生物源蛋白质是制备生物肽的重要药源。方格星虫(Sipunculus nudus)，又称光裸星虫、沙蚕等，主要分布在大西洋、太平洋以及我国的广东、广西、海南和福建沿海。《中华本草》中记载星虫具有降血压的作用。
[0004]血管紧张素转化酶抑制肽(angiotensin converting enzymeinhibitory peptides)是一种对ACE活性具有抑制作用的多肽类物质，一般由2～20个氨基酸残基组成，一般是由蛋白质酶解而得，其通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性，阻碍血管紧张素Ⅱ的生成以及抑制血管舒缓激肽的分解而达到降血压的作用。ACE抑制肽的活性，取决于多肽的氨基酸种类、序列及其空间结构，其均会被酶解工艺参数影响。因此在生物肽的制备过程中，酶解工艺参数的确定以及后期的筛选及分离纯化成为技术的关键所在。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种方格星虫ACE抑制肽及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，提供具有良好降压效果的方格星虫ACE抑制肽，并确定最佳的酶解工艺参数和筛选分离纯化技术。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种方格星虫ACE抑制肽组合物，所述的方格星虫ACE抑制肽组合物包括如下的一种或多种多肽：
[0008]1)如SEQ ID NO.1所示的多肽；
[0009]2)如SEQ ID NO.2所示的多肽；
[0010]3)如SEQ ID NO.3所示的多肽。
[0011]本专利技术还提供所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0012]1)酶解提取：将绞碎的方格星虫加纯水混匀后，加入以纯水溶解成浆的复合酶粉，45℃，酶解4
‑
6h，之后95℃灭酶5min，离心去除沉淀，上清液进行超滤透析，截取100kDa的超滤液；所述复合酶粉为胰蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1配成；酶粉浆加入量为方格星
虫重量的0.5％
‑
1％；
[0013]2)纯化：聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质进行色谱柱层析，上样缓冲液为内含0.5mol/L氯化钠的pH6.8磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH5.0柠檬酸缓冲液，收集三段色谱峰得到纯化的小分子肽，即为方格星虫ACE抑制肽组合物。
[0014]优选的，步骤1)中，绞碎的方格星虫与纯水的料液比为1：10
‑
1：15。
[0015]优选的，步骤1)中，绞碎的方格星虫与纯水混匀后，用1％的氢氧化钠溶液调节pH为7.5。
[0016]优选的，步骤1)中，酶粉浆加入量为方格星虫重量的1％。
[0017]优选的，所述步骤2)中的聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质为聚乙二醇修饰铜离子螯合琼脂糖。
[0018]本专利技术还提供所述的方格星虫ACE抑制肽组合物在制备降血压的药物中的应用。
[0019]本专利技术还提供一种降压肽口含片，所述的降压肽口含片配方为：按质量份数计，权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物10
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15％，辅料35
‑
50％，甜味剂15
‑
20％，酸味剂5
‑
10％。
[0020]本专利技术还提供所述的降压肽口含片的制备方法，将主料、辅料和食品添加剂混合，向混合物缓慢喷洒50％
‑
70％乙醇作为润湿剂，同时不断搅拌均匀，制成软硬适中的软料；以18目筛作为制颗粒的工具，压过18目筛，使软料变成颗粒状制备软材，之后将颗粒状制备软材压片，置于50
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60℃干燥1
‑
2小时直到含水量2
‑
4wt％，得到所述降压肽口含片。
[0021]优选的，压片时颗粒状制备软材中加入1
‑
1.5wt％的硬脂酸镁作为润滑剂。
[0022]本专利技术公开了以下技术效果：
[0023](1)ACE抑制肽的活性，取决于多肽的氨基酸种类、序列及其空间结构，在酶解过程中，蛋白质大分子首先被蛋白酶切割成多肽片段，随着酶解程度加深，多肽被进一步酶解切割形成游离氨基酸。因此，控制好酶解工艺参数(包括酶的种类、用量、pH值、温度、酶解时间)，可控制切割位点及酶解程度，这对于多肽片段的大小及结构具有决定作用。在方格星虫匀浆液的酶解过程中，若酶解不足，则星虫蛋白以大分子状态存在，不能切割得到具有ACE抑制活性的肽段，若酶解过度，则肽段被进一步切割形成游离氨基酸，不具有活性结构，从而失去了ACE抑制活性。本工艺经过大量实验，确定的酶解工艺参数具有良好的酶解效果，能得到高活性的ACE抑制肽。
[0024](2)酶解液经超滤脱盐后，使用截留分子量100KDa的超滤膜，获得分子量小于100KDa的组分，该组分活性较高，经小试分离得到序列肽段为9肽
‑
11肽，分子量约1KDa，酶解液中大量残留的部分大分子蛋白难以去除，影响活性多肽的纯度。常规的凝胶排阻色谱可根据分子量纯化蛋白质及多肽，但耗时长、处理量小，限制了工业化应用。固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术以其对蛋白质吸附容量大，易洗脱，易再生等优点，可有效应用于蛋白质或小分子肽的分离纯化。在表面接枝长链结构的聚乙二醇(PEG)可以使介质具备对大分子的体积排阻功能，因此，选择IMAC分离活性小分子肽时，可通过在介质表面修饰PEG减少非目标大分子吸附，以提高对目标小分子的分离效果。利用PEG形成半渗透屏障制备的新型限进介质能够在有效的抑制大分子蛋白吸附的同时提高对小分子肽的选择性吸附。本专利技术选择在混合体系中具有一定的限进作用的聚乙二醇单甲醚－5000(mPEG5000)修饰的IMAC介质，成功从复杂的生物体系中分离出低浓度的活性小分子肽。
[0025](3)本专利技术提供的口含片制备工艺简单，适于人体吸收，能够起到较好的降压作用。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种方格星虫ACE抑制肽组合物，其特征在于，所述的方格星虫ACE抑制肽组合物包括如下的一种或多种多肽：1)如SEQ ID NO.1所示的多肽；2)如SEQ ID NO.2所示的多肽；3)如SEQ ID NO.3所示的多肽。2.一种权利要求1所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)酶解提取：将绞碎的方格星虫加纯水混匀后，加入以纯水溶解成浆的复合酶粉，45℃，酶解4
‑
6h，之后95℃灭酶5min，离心去除沉淀，上清液进行超滤透析，截取100kDa的超滤液；所述复合酶粉为胰蛋白酶与中性蛋白酶按照质量比3:1配成；酶与底物质量比为方格星虫重量的0.5％
‑
1％；2)纯化：聚乙二醇修饰金属鳌合亲和层析介质进行色谱柱层析，上样缓冲液为内含0.5mol/L氯化钠的pH6.8磷酸钠缓冲液，洗脱缓冲液为pH5.0柠檬酸缓冲液，收集三段色谱峰得到纯化的小分子肽，即为方格星虫ACE抑制肽组合物。3.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，绞碎的方格星虫与纯水的料液比为1：10
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1：15。4.根据权利要求2所述的方格星虫ACE抑制肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，绞碎的方格星虫与纯水混匀后，用1％的氢氧化钠溶液调节pH为7.5。5.根据权利要求2所述的方格星虫...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚怡，吕应年，罗辉，林芊杏，唐晓宁，刘欢，
申请(专利权)人：广东湛江海洋医药研究院，
类型：发明
国别省市：