FLNA、FBLN1、TSP-1作为标志物在制备石棉相关疾病检测试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了FLNA、FBLN1、TSP‑1作为标志物在制备石棉相关疾病检测试剂盒中的应用，属于生物医学技术领域。本发明专利技术基于iTRAQ结合2D LC‑MS/MS技术筛选出血清差异蛋白Filamin A(FLNA)、Fibulin‑1(FBLN1)和Thrombospondin‑1(TSP‑1)，经进一步验证FLNA、FBLN1、TSP‑1可作为恶性间皮瘤诊断的潜在生物标志物，具有较高的灵敏度和特异度，FBLN1、TSP‑1可作为石棉肺诊断的潜在生物标志物，具有重要的临床应用价值，且多指标联合使用时，其诊断价值更高。

【技术实现步骤摘要】
FLNA、FBLN1、TSP-1作为标志物在制备石棉相关疾病检测试剂盒中的应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及FLNA、FBLN1、TSP-1作为生物标志物在制备石棉相关疾病如恶性间皮瘤、石棉肺的诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
恶性间皮瘤(malignantmesothelioma，MM)是一种相对少见，与石棉暴露密切相关的高度侵袭性肿瘤，多发生于胸膜和腹膜，还有少数发生于心包膜、输卵管浆膜、睾丸鞘膜等。该病起病隐匿，缺乏特异性临床表现，大多数患者确诊时已处于晚期，目前尚无有效治疗方案，预后很差，一般中位生存期不超过一年。恶性间皮瘤的平均潜在寿命损失年数(PYLL)为17年。由于潜伏期长(20-40年)和一些国家持续使用石棉，全球恶性间皮瘤每年死亡人数仍在增加，相应的社会经济负担也继续上升。缺乏有效的早期诊断方法是MM生存期低的主要因素。虽然组织学和免疫组织化学方法是诊断MM的金标准，但组织活检的侵袭性和技术要求限制了其在早期筛查中的应用。影像学诊断确诊困难，且成本较高并使病人每年接受较高剂量的辐射。胸腔或腹腔积液细胞学检查在诊断MM时不够敏感和特异，并且部分MM患者早期甚至没有明显的胸水或腹水。近年来，肿瘤标志物被广泛用于肿瘤的早期筛查、辅助诊断，提高了恶性肿瘤的生存率。尽管许多生物标志物被提出可用于恶性间皮瘤的诊断，如透明质酸、可溶性间皮素相关蛋白、骨桥蛋白、巨核细胞促进因子、腓骨蛋白-3、血清高迁移率族蛋白B1等，但多存在敏感度或特异度不够的问题，且尚需在大样本人群研究中进行验证，限制了其在临床上的应用。因此，寻找发现新一代的可用于有效诊断的标志物仍是长期需要的。除了MM，接触石棉还可导致其他石棉相关疾病(asbestos-relateddiseases,ARDs)，如石棉肺、胸膜斑(pleuralplaques,PP)、胸膜炎和肺癌。慢性石棉相关疾病通常在最初接触石棉纤维后潜伏20-40年后出现。因此，亟需寻找合适的用于评估石棉暴露水平、常见的ARDs，或特别是MM的生物标志物，以监测有石棉暴露史的工人及其家属。蛋白质组学的开展和研究及其新兴技术的出现为尽早发现肿瘤标志物提供了可能。相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(2D-LC-MS/MS)技术可同时对多组不同样本进行相对和绝对定量研究，且比其他蛋白质组学定量方法更加敏感，是一种理想的寻找生物标记的技术，已被应用于多种肿瘤的生物标志物研究中。血清蛋白质组学具有易得性、无侵袭性和对疾病快速反应的优点。血清蛋白的动态监测可为疾病的诊断、治疗和预后提供有价值的信息。以iTRAQ为基础的血清蛋白质组学方法可能为筛选理想的MM生物标志物提供广阔的前景。但是，目前还没有基于iTRAQ的MM血清蛋白质组学报道。本专利技术期望借助iTRAQ技术联合2DLC-MS/MS技术实现高灵敏度、较好特异性的MM生物标志物的筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能够高灵敏度、特异性鉴别石棉相关疾病特别是恶性间皮瘤的生物标志物，将其应用于恶性间皮瘤疾病的诊断、治疗和预后评估。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于iTRAQ蛋白质组学技术筛选恶性间皮瘤血清生物标志物，包括以下步骤：(1)取健康人群与恶性间皮瘤患者血清进行蛋白质提取和定量；(2)蛋白酶解和除盐：利用Tryspin酶对每个蛋白样本消化酶解，再利用Strata-XC18柱除盐；(3)iTRAQ标记肽段：参照iTRAQreagate-8plexMultiplex试剂盒说明书对肽段进行同位素标记；(4)高pH值的HPLC分离标记肽段：将标记的肽段等量混合，在ThermoDINOEXUltimate3000BioRS系统上分级，分析柱是DurashellC18(5um,4.6x250mm)，共收集到12个组分；(5)LC-MS/MS质谱检测：LC-MS/MS分析采用ABSCIEXnanoLC-MS/MS(TripleTOF5600plus)系统；(6)蛋白质鉴定及生物信息学分析：使用ProteinPilot4.5软件搜索Uniprot数据库对原始MS/MS文件数据进行分析；对于鉴定到的蛋白，认为unusedscore≥1.3(即可信度水平在95％以上)，每个蛋白至少包含一个unique肽段的蛋白为可信蛋白，对于鉴定的肽段，以conf≥95过滤，即可信度在95％以上认为可信肽段。然后根据蛋白的丰度比≥1.5倍且经统计检验其P＜0.05筛选出差异表达蛋白质。使用Genesis软件对差异表达蛋白进行层次聚类分析。利用GO数据库和KEGG数据库对差异蛋白进行功能注释和生物通路信息分析。为了得到候选生物标志物，对差异蛋白进行GO富集分析和KEGGPathway富集分析。根据前期iTRAQ定量结果，结合生物信息学分析和恶性间皮瘤的可能发病机制，我们筛选了三个候选生物标志物FilaminA(FLNA)、Fibulin-1(FBLN1)和Thrombospondin-1(TSP-1)进行了验证。通过确征，MM组血清FLNA水平(298.23±89.98pg/ml)明显高于健康对照组、AE<10y组和AE≥10y组(P<0.01)；MM组血清FBLN1水平(412.48±110.68ng/ml)和TSP-1水平(5897.3(6286.0)ng/ml)则显著低于健康对照组、AE组和PP组(P<0.01)，MM组的血清FBLN1水平显著低于石棉病组(P<0.05)。因此，差异蛋白FilaminA、Fibulin-1和Thrombospondin-1可作为生物标志物用于制备诊断恶性间皮瘤的产品。尤其是Fibulin-1、Thrombospondin-1更适合作为生物标志物用于制备诊断恶性间皮瘤的产品。本专利技术提供了FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白作为生物标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用。研究表明，多指标的联用较单一指标诊断价值更高。进一步地，FBLN1和TSP-1联用作为生物标志物用于制备恶性间皮瘤检测试剂盒，更进一步，上述三个指标联用作为生物标志物用于制备恶性间皮瘤检测试剂盒。进一步地，所述检测试剂盒中包含测定血清中FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白含量的试剂。进一步地，所述试剂为抗FLNA、FBLN1或TSP-1的抗体。具体地，可采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对目标蛋白进行检测。本专利技术还提供了一种基于检测血清中FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白含量的恶性间皮瘤诊断试剂盒，包括抗FLNA、FBLN1或TSP-1的抗体。本专利技术研究表明，FBLN1和TSP-1在用于区分石棉肺和健康对照人群或AE<10Y人群时具有较高的诊断价值，且指标联合使用时诊断价值较单一指标诊断价值更高。因此，本专利技术提供了FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白作为生物标志物在制备石棉肺鉴别诊断试剂盒中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白作为生物标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白作为生物标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中包含测定血清中FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白含量的试剂。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂为抗FLNA、FBLN1或TSP-1的抗体。


4.一种基于检测血清中FLNA、FBLN1、TSP-1中至少一种蛋白含量的恶性间皮瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括抗FLNA、FBLN1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼建林，夏海玲，冯玲芳，蒋兆强，余珉，王晶，陈钧强，张幸，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33