【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量药物产品效力的基于细胞的测定相关申请的交叉引用本申请要求2018年6月8日提交的美国临时专利申请号62/682,263的优先权，将该文献的内容通过援引以其全文并入本文。通过援引并入序列表本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此通过援引以其全文并入。2019年6月4日创建的所述ASCII拷贝名为AVEX-004001WO_ST25.txt且大小为25千字节。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(parvoviridae)的成员。AAV基因组由线性单链DNA分子构成，该分子含有大约4.7千碱基(kb)并且由编码非结构性Rep(复制)和结构性Cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框组成。侧接AAV编码区的是两个顺式作用的核苷酸反向末端重复(ITR)序列，长度为大约145个核苷酸，具有中断的回文序列，这些回文序列可以折叠成在DNA复制起始期间作为引物发挥功能的发夹结构。除了它们在DNA复制中的作用外，已显示ITR序列对于病毒整合、从宿主基因组中拯救以及将病毒核酸衣壳化为成熟病毒体也是...
【技术保护点】
1.一种用于测量转基因表达的方法，该方法包括：/na)提供第一多个终末分化神经祖细胞(NPC)；/nb)用包含病毒载体的测试样品转导该第一多个终末分化NPC，该病毒载体包含编码目的蛋白的序列；/nc)在足以表达该目的蛋白的条件下孵育所转导的该第一多个终末分化NPC；/nd)使来自(c)的该第一多个终末分化NPC与对该目的蛋白具有特异性的分子接触；/ne)对该第一多个终末分化NPC进行成像，以获得积分荧光强度/细胞(IFI-C)测定读出；并且/nf)基于该IFI-C读出测定该目的蛋白的表达。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180608 US 62/682,2631.一种用于测量转基因表达的方法，该方法包括：
a)提供第一多个终末分化神经祖细胞(NPC)；
b)用包含病毒载体的测试样品转导该第一多个终末分化NPC，该病毒载体包含编码目的蛋白的序列；
c)在足以表达该目的蛋白的条件下孵育所转导的该第一多个终末分化NPC；
d)使来自(c)的该第一多个终末分化NPC与对该目的蛋白具有特异性的分子接触；
e)对该第一多个终末分化NPC进行成像，以获得积分荧光强度/细胞(IFI-C)测定读出；并且
f)基于该IFI-C读出测定该目的蛋白的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中该第一多个终末分化NPC对于运动神经元存活基因(SMN1)-/-突变是纯合的。
3.如权利要求2所述的方法，其中该SMN1-/-突变包括SMN1外显子7的缺失(Δ7)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中孵育步骤c)之后是固定和透化该第一多个终末分化NPC。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，该方法包括：
g)提供第二多个终末分化NPC；
h)用包含该病毒载体的参考标准品转导该第二多个终末分化NPC；
i)在足以表达该目的蛋白的条件下孵育所转导的该第二多个终末分化NPC；
j)使来自(i)的该第二多个终末分化NPC与对该目的蛋白具有特异性的分子接触；
k)对该第二多个终末分化NPC进行成像，以获得积分荧光强度/细胞(IFI-C)测定读出；并且
l)比较该第一多个终末分化NPC的IFI-C与该第二多个终末分化NPC的IFI-C；
从而测定该测试样品的该病毒载体相对于该参考标准品的相对效力。
6.如权利要求5所述的方法，其中该第二多个终末分化NPC对于SMN1-/-突变是纯合的。
7.如权利要求6所述的方法，其中该SMN1-/-突变包括SMN1外显子7的缺失(Δ7)。
8.如权利要求4或5所述的方法，其中孵育步骤(i)之后是固定和透化该第二多个终末分化NPC。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一多个终末分化NPC和所述第二多个终末分化NPC是通过使从SMN1-/-小鼠胚胎的皮层分离的神经祖细胞终末分化而产生的。
10.如权利要求9所述的方法，其中这些神经祖细胞(NPC)是通过以下方式终末分化的：
a.将这些NPC在含有表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基中培养以形成神经球；
b.解离所述神经球以产生经解离的NPC；并且
c.将这些经解离的NPC在不具有生长因子的富血清培养基中培养；
从而产生终末分化NPC。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞被该测试样品和该参考标准品在该病毒载体的至少两种不同的感染复数(MOI)下转导。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞在该测试样品和该参考标准品中的该病毒载体的5种不同的MOI下被转导。
13.如权利要求12所述的方法，其中该5种MOI包括300,000、150,000、75,000、37,500、18,750个病毒颗粒/细胞。
14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中比较步骤(l)包括针对该测试样品和该参考标准品中的每一种绘制MOI相对于IFI-C的标准曲线。
15.如权利要求5-14中任一项所述的方法，其中该比较步骤(l)包括针对该测试样品和该参考标准品中的每一种计算logMOI相对于IFI-C的线性回归，从而得出测试样品斜率和参考标准品斜率。
16.如权利要求5-15中任一项所述的方法，其中测定该病毒载体的相对效力是通过平行线分析(PLA)来进行，并且其中该PLA包括测量该测试样品斜率相对于该参考标准品斜率的斜率比。
17.如权利要求16所述的方法，其中该参考标准品斜率大于或等于1、02E+05。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中该斜率比在0、69-1、45之间。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中该斜率比在0、75与1、33之间。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，该方法包括计算该样品的线性回归的变异系数。
21.如权利要求20所述的方法，其中该变异系数在15、6％与29、5％之间。
22.如权利要求20所述的方法，其中该变异系数小于或等于40％、小于或等于30％或小于或等于20％。
23.如权利要求16-22中任一项所述的方法，该方法包括计算该测试样品和该参考标准品的线性回归的R2值。
24.如权利要求23所述的方法，其中该测试样品和该参考标准品的R2值大于或等于0、95。
25.如权利要求16-24中任一项所述的方法，该方法包括计算该参考标准品的测定动态窗。
26.如权利要求25所述的方法，其中该测定动态窗大于或等于2.69。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中该目的蛋白是运动神经元存活(SMN1)蛋白。
28.如权利要求27所述的方法，其中该SMN1蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中该病毒载体是腺相关病毒血清型9(AAV9)。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中该病毒载体包含与编码该SMN1蛋白的序列可操作地连接的编码巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡-β-肌动蛋白杂合启动子(CB)的序列。
31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其中该病毒载体包含来自AAV血清型2(AAV2)DNA的AAV反向末端重复序列(ITR)。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中该病毒载体包含SEQIDNO:1的序列。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中这些细胞在用该病毒载体转导之前传代8至15次。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该IFI-C读出反映了蛋白质表达的量度。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中在转导后孵育这些终末分化NPC的该步骤进行约69-75小时。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中对该目的蛋白具有特异性的该分子包括抗体、抗体片段或适体。
37.如权利要求36所述的方法，其中该抗体包括对该目的蛋白具有特异性的抗体。
38.如权利要求37所述的方法，其中以约4μg/mL的浓度提供该抗目的蛋白抗体。
39.如权利要求37所述的方法，其中以约2μg/mL的浓度提供该抗目的蛋白抗体。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中该分子包括可检测标记。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，该方法进一步包括洗涤这些终末分化NPC以去除对该目的蛋白具有特异性的该分子。
42.如权利要求1-38中任一项所述的方法，该方法进一步包括使这些终末分化NPC与特异性识别对该目的蛋白具有特异性的该分子的第二分子接触。
43.如权利要求42所述的方法，其中该第二分子包括可检测标记。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中该第二分子包括抗体、抗体片段或适体。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在固定和透化步骤之后，使这些终末分化NPC与抗细胞核可检测标记接触。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中这些终末分化NPC在固体表面上。
47.如权利要求46所述的方法，其中该固体表面包被有聚D-赖氨酸。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中以20,000个细胞/孔的密度接种这些终末分化NPC。
49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中该方法允许定量测量该目的蛋白的水平的剂量依赖性增加。
50.一种试剂盒，该试剂盒包括：
a.能够用病毒载体转导的多个细胞；
b.编码目的蛋白的病毒载体；
c.能够结合该目的蛋白的第一分子；
d.能够结合该第一分子的第二分子，其中该第二分子包括可检测标记；以及，
e.在成像测定中的使用说明书。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中该多个细胞包括神经祖细胞(NPC)。
52.如权利要求51所述的试剂盒，其中这些NPC对于SMN1-/-突变是纯合的。
53.如权利要求51所述的试剂盒，其中该SMN1-/-突变是外显子7的缺失(Δ7)。
54.如权利要求50-53中任一项所述的试剂盒，其中该病毒载体是腺相关病毒血清型9(AAV9)，该腺相关病毒血清型9包含在巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡-β-肌动蛋白杂合启动子(CB)的控制下表达SMN1蛋白的cDNA、和来自AAV血清型2(AAV2)DNA的两个AAV反向末端重复序列(ITR)。
55.如权利要求50-54中任一项所述的试剂盒，其中该第一分子包括抗SMN1抗体。
56.如权利要求50-55中任一项所述的试剂盒，其中该第二分子包括对所述第一分子具有特异性的抗体。
57.如权利要求56所述的试剂盒，其中该第二分子包括可检测标记。
58.如权利要求50-57中任一项所述的试剂盒，其中该目的蛋白是运动神经元存活(SMN1)蛋白。
59.一种产生包含含有转基因的病毒载体的药物组合物的方法，该方法包括：
a.产生该含有该转基因的病毒载体；
b.根据如权利要求1-49中任一项所述的用于测量该转基因的方法测定所述病毒载体；并且
c.将该含有该转基因的病毒载体配制在药物组合物中。
60.如权利要求59所述的方法，其中产生该病毒载体包括：
a.培养粘附型细胞；
b.用一种或多种质粒转染这些粘附型细胞以使得能够产生该AAV病毒载体；
c.裂解这些粘附型细胞以分离该AAV病毒载体；
d.酸化和澄清化(c)的该细胞裂解物；
e.使用阳离子交换色谱(CEX)纯化(d)的产物；
f.使用切向流过滤(TFF)过滤(e)的产物；
g.将(f)的产物在氯化铯(CsCl)缓冲液中超速离心；并且
h.从(g)的产物中收集这些AAV病毒载体。
61.如权利要求60所述的方法，其中该AAV是AAV9。
62.如权利要求60或61所述的方法，其中该AAV是自身互补型的(scAAV)。
63.如权利要求60-61中任一项所述的方法，其中这些粘附型细胞是HEK293细胞。
64.如权利要求60-63中任一项所述的方法，其中在培养之前针对粘附性对这些粘附型细胞进行选择。
65.如权利要求60-64中任一项所述的方法，其中该选择包括多次继代培养这些粘附型细胞以选择粘附性。
66.如权利要求60-65中任一项所述的方法，其中将这些粘附型细胞接种在生物反应器中以进行培养。
67.如权利要求66所述的方法，其中该生物反应器是可以提供细胞培养基的连续循环的大规模生物反应器。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中该生物反应器是200m2、333m2或500m2生物反应器。
69.如权利要求66-68中任一项所述的方法，其中将这些粘附型细胞添加至再循环培养基袋中的培养基，并循环通过该生物反应器。
70.如权利要求69所述的方法，其中将这些细胞使用蠕动泵循环。
71.如权利要求70所述的方法，其中该蠕动泵送是连续的，同时将这些粘附型细胞接种在生物反应器中以进行培养。
72.如权利要求71所述的方法，其中接种密度是约8,000-12,000个细胞/cm2。
73.如权利要求60-72中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括将转染培养基添加至该再循环培养基袋，并使该转染培养基循环通过该生物反应器。
74.如权利要求73所述的方法，其中将该转染培养基使用蠕动泵循环。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中该循环在15℃-25℃之间发生。
76.如权利要求60-75中任一项所述的方法，其中转染步骤包括使该粘附型细胞与腺病毒辅助质粒(pHELP)接触。
77.如权利要求60-76中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与编码AAVrep基因的质粒接触。
78.如权利要求60-77中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与编码AAVcap基因的质粒接触。
79.如权利要求60-78中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与在同一质粒(pAAV)上编码AAVrep基因和AAVcap基因的质粒接触。
80.如权利要求77或权利要求79所述的方法，其中该AAVrep基因是rep2。
81.如权利要求78或79所述的方法，其中该AAVcap基因是cap9。
82.如权利要求60-81中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与转染剂聚乙烯亚胺(PEI)接触。
83.如权利要求82所述的方法，其中PEI与这些质粒中的至少一种的比率是按重量计小于1:1。
84.如权利要求82所述的方法，其中PEI与这些质粒中的至少一种的比率是按重量计约1:1。
85.如权利要求73-84中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与不含血清的转染培养基接触。
86.如权利要求60-85中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与不含钙的转染培养基接触。
87.如权利要求60-86中任一项所述的方法，其中该转染步骤包括使该粘附型细胞与不含谷氨酰胺的转染培养基接触。
88.如权利要求60-87中任一项所述的方法，其中该转染步骤进行10-60分钟、10-30分钟、20-30分钟、15-30分钟或进行少于30分钟。
89.如权利要求60-88中任一项所述的方法，其中裂解步骤包括全细胞裂解。
90.如权利要求60-89中任一项所述的方法，其中该裂解步骤包括使用补充有核酸内切酶的裂解缓冲液。
91.如权利要求90所述的方法，其中该核酸内切酶是全能核酸酶。
92.如权利要求60-91中任一项所述的方法，其中该裂解步骤包括使用补充有吐温的裂解缓冲液。
93.如权利要求60-92中任一项所述的方法，其中该裂解步骤在15℃-25℃之间进行。
94.如权利要求60-93中任一项所述的方法，该方法进一步包括在(d)的酸化步骤之前冷冻步骤(c)的细胞裂解物。
95.如权利要求60-94中任一项所述的方法，其中该CsCl缓冲液是2-4MCsCl缓冲液。
96.如权利要求60-94中任一项所述的方法，其中该CsCl是在约3M的浓度下。
97.如权利要求60-96中任一项所述的方法，该方法进一步包括(i)将(g)的产物通过切向流过滤进行过滤。
98.如权利要求60-98中任一项所述的方法，其中该酸化步骤包括将该细胞裂解物酸化至约3.0-4.0、约3.3-3.7或约3.4-3.6的pH。
99.如权利要求98所述的方法，其中该酸化步骤包括将该细胞裂解物酸化至约3、5的pH。
100.如权利要求60-99中任一项所述的方法，其中该超速离心在约40,000-50,000rpm之间或约43,000-46,000rpm之间进行。
101.如权利要求60-100中任一项所述的方法，其中该超速离心在15℃-25℃之间进行。
102.如权利要求60-101中任一项所述的方法，其中该超速离心进行16-24小时或20-24小时。
103.如权利要求60-102中任一项所述的方法，其中在该酸化步骤之前将该细胞裂解物与吐温一起孵育。
104.如权利要求60-103中任一项所述的方法，其中在该酸化步骤之前将该细胞裂解物与吐温一起孵育约8-20小时。
105.如权利要求60-104中任一项所述的方法，其中澄清化步骤包括将该细胞裂解物通过深层过滤器过滤。
106.如权利要求60-105中任一项所述的方法，其中该澄清化步骤包括将该细胞裂解物通过0、45微米过滤器过滤。
107.如权利要求60-106中任一项所述的方法，其中该CEX包括磺酰基树脂。
108.如权利要求60-107中任一项所述的方法，其中至少一个TFF步骤包括使用分子量截留值为300kDaMW的纤维素膜。
109.如权利要求60-108中任一项所述的方法，其中该TFF步骤将该阳离子交换步骤的洗脱液体积减少至少六倍。
110.如权利要求60-109中任一项所述的方法，其中该CsCl缓冲液包含Tris、MgCl2和泊洛沙姆188。
111.如权利要求110所述的方法，其中该CsCl缓冲液包含约20mMTris。
112.如权利要求110或111所述的方法，其中该CsCl缓冲液包含约2mMMgCl2。
113.如权利要求110-112中任一项所述的方法，其中该CsCl缓冲液包含泊洛沙姆188，任选地约0.2％w/v泊洛沙姆188。
114.如权利要求60-113中任一项所述的方法，其中该CsCl缓冲液在约pH7.5-8.5之间或在约pH7.9-8.2之间。
115.如权利要求60-114中任一项所述的方法，其中在从经超速离心的细胞裂解物中收集这些AAV病毒载体后，空病毒衣壳的数量占总病毒衣壳的少于7％、少于5％、少于3％或少于1％。
116.如权利要求115所述的方法，其中该空病毒衣壳的数量是通过分析型超速离心(AUC)来测量。
117.如权利要求60-116中任一项所述的方法，其中使用注射器从该经超速离心的细胞裂解物中收集这些AAV病毒载体。
118.如权利要求60-117中任一项所述的方法，其中在第二TFF步骤之后收集的这些AAV病毒载体储存在包含Tris、MgCl2、NaCl和泊洛沙姆188的溶液中。
119.如权利要求118所述的方法，其中该溶液包含约20mMTris。
120.如权利要求118或119所述的方法，其中该溶液包含约1mMMgCl2。
121.如权利要求118-120中任一项所述的方法，其中该溶液包含约200mMNaCl。
122.如权利要求118-121中任一项所述的方法，其中该溶液包含约0.005％w/v泊洛沙姆188。
123.如权利要求118-122中任一项所述的方法，其中该溶液在约pH7.5-8.5之间或在约pH7.7-8.3之间。
124.如权利要求60-123中任一项所述的方法，其中在该第二TFF之后收集的这些AAV病毒载体含有少于约30μg/g或少于约20μg/g的CsCl。
125.如权利要求60-124中任一项所述的方法，其中在该第二TFF之后收集的AAV病毒载体的浓度大于或等于约3x1013vg/ml。
126.如权利要求60-125中任一项所述的方法，其中利用用洗涤剂的絮凝来从该细胞裂解物中去除宿主细胞蛋白和/或宿主细胞DNA。
127.如权利要求60-120中任一项所述的方法，其中该AAV病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸。
128.如权利要求76-127中任一项所述的方法，其中编码该SMN蛋白的质粒、编码该pAAV的质粒和编码该pHELP的质粒以1:1:1的比率转染。
129.如权利要求60-128中任一项所述的方法，其中该药物组合物包含：
a.1-8x1013之间个AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)；
b.少于约7％的空病毒衣壳；
c.每1x1013vg/mL少于约100ng/mL的宿主细胞蛋白；
d.每1x1013vg/mL少于约5x106pg/mL的残留宿主细胞DNA；
并且其中该1-8x1013个AAV9病毒载体基因组/mL中的至少约80％是功能性的。
130.如权利要求129所述的方法，其中该药物组合物包含1.7-2.3x1013之间的AAV9vg/mL或1.9-2.1x1013之间的AAV9vg/mL。
131.如权利要求129所述的方法，其中该药物组合物包含约2x1013AAV9vg/mL。
132.如权利要求129-131中任一项所述的方法，其中该药物组合物包含少于约5％的空衣壳、少于约3％的空衣壳或少于约1％的空衣壳。
133.如权利要求129-132中任一项所述的方法，其中该药物组合物包含1-2x1014vg的该AAV9病毒载体或1.1x1014vg的该AAV9病毒载体，或由其组成。
134.如权利要求129-132中任一项所述的方法，其中该药物组合物由1.7x1014vg的该AAV9病毒载体组成。
135.如权利要求129-134中任一项所述的方法，其中该药物组合物是水性药物配制品。
13...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·卡什帕，A·卡什帕，K·福斯特，M·弗戈热，E·帕克，G·汤姆森，F·左，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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