一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，包括遗传转化受体的获取，农杆菌培养与浸染液制备，愈伤浸染，共培养，除菌，抑菌培养，筛选培养，抗性愈伤的鉴定。本发明专利技术利用酸枣茎段、叶片、子叶、胚轴诱导的愈伤为受体，建立酸枣遗传转化的方法。愈伤来源广泛，转化效率高，可重复性高，操作步骤简单；借助荧光标记方法辅助筛选，方便快捷；该体系为枣基因功能解析提供了便利，同时也为枣的遗传改良提供了可能。

【技术实现步骤摘要】
一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法
本专利技术涉及一种植物细胞工程和分子生物学
，尤其涉及的是一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法。
技术介绍
枣(ZizipHusjujubaMill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyhpus.)多年生木本作物，是我国特有的果树。枣品种繁多，枣果营养价值丰富，且具有抗氧化，抑菌消炎安神助眠，滋阴补血等功效，在食品和医药方面有着广泛的应用价值。酸枣(ZizipHusjujubaMill.var.Spinosa)，作为枣的野生种，在我国分布广泛。随着果树功能基因组学的发展，科研工作者希望能对枣树遗传背景和基因功能信息有进一步的了解，以便更好对枣树品种进行改良。但枣花小，人工去雄困难，坐果率低，胚败育现象严重等使得枣树杂交育种困难，长期进行无性繁殖，导致人们至今对枣树遗传背景和基因功能信息仍知之甚少。枣树全基因组测序已经完成，急需来源广泛的遗传转化受体以及高效的遗传转化体系以解析枣基因组信息和进行基因功能的鉴定。酸枣作为枣的野生种，来源广泛，其愈伤组织为脱分化状态的组织，是良好的遗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)遗传转化受体的获取/n播种酸枣无菌种子，待无菌苗长出真叶，选取酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴，分别切成0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基，诱导酸枣愈伤，作为遗传转化材料；/n(2)农杆菌培养与浸染液制备/n将携带有植物表达载体pCAMBIA2300-GFP农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，直至OD

【技术特征摘要】
1.一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)遗传转化受体的获取
播种酸枣无菌种子，待无菌苗长出真叶，选取酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴，分别切成0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基，诱导酸枣愈伤，作为遗传转化材料；
(2)农杆菌培养与浸染液制备
将携带有植物表达载体pCAMBIA2300-GFP农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，直至OD600为0.6～0.8；
将所述OD600为0.6～0.8的农杆菌菌液用液体MS重悬，得到浸染液，此前已经于超净台向液体MS中加入200μmol/L的乙酰丁香酮；
(3)愈伤浸染：
将步骤(2)所得的浸染液与酸枣愈伤组织于恒温摇床以28℃、100～150rpm的条件黑暗共培养30～35min，得到浸染后的外植体；
(4)共培养：
将步骤(3)所得浸染后的酸枣愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天；
(5)除菌：
用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗步骤(4)所得的酸枣愈伤7～8min，重复3～4次；
(6)抑菌培养：
将步骤(5)得到的酸枣愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天；
(7)筛选培养：
将步骤(6)所得的抑菌培养后的酸枣愈伤置于半固体MS筛选培养基，经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的转基因酸枣愈伤；
(8)抗性愈伤的鉴定：
利用RT-PCR方法对遗传转化后的酸枣愈伤进行检测，根据是否有报告基因的条带，确定目的基因的整合状况。


2.根据权利要求1所述的一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述半固体MS愈伤诱导培养基包括0.5～2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊，马福利，李亚梅，黄锦秋，周军永，陆丽娟，孙其宝，
申请(专利权)人：安徽农业大学，安徽省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34