一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用BnXTH2基因提高植物抗寒能力的方法，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中异源表达。实验证明，通过将BnXTH2基因在辣椒体内异源表达可明显提高辣椒抗寒能力。

【技术实现步骤摘要】
一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法。
技术介绍
辣椒(CapsicumanmuumL.)是一种重要的喜温性蔬菜,在北方保护地种植面积较大,但由于冬季温度低,光照弱,影响了北方地区辣椒的生产。苗期越冬易受突然寒流低温(0℃以下)霜冻或早春阴雨低温(0℃以上)的冷害,严重影响辣椒的生长、早期产量和商品性。急需一种增强辣椒抗寒冬的一种技术。近期的研究发现XTH5/7过表达(oxXTH5、oxXTH7)转基因植物在低温处理下植株存活率实验发现，过表达XTH基因能够促进辣椒细胞壁中半纤维素的积累从而增强植株抗冻性。番茄XTH3基因也发现与植物抗寒性相关。利用BnXTH2基因增强辣椒抗寒能力，可以有效解决辣椒抗寒的问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，经过实验表明，利用苎麻BnXTH2基因可以有效提高辣椒的抗寒能力。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，所述方法具体为将苎麻BnXTH2基因在辣椒中过表达。进一步地，所述方法包括如下步骤：S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；1.3)将表达载体pBI121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；1.5)质粒提取：将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；1.6)转化EHA105：利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5；2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6-BA3mg/L+NAA0.8mg/L+Tim300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA0.7mg/L+Tim300mg/L+Kan100mg/L，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。S3、转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量。具体地说，不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％，因此可以判定BnXTH2基因在辣椒体内表达可明显提高辣椒抗寒能力。本专利技术的有益效果在于：实验证明，通过将BnXTH2基因在辣椒体内过表达可明显提高辣椒抗寒能力。具体实施方式以下对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。实施例1一、总RNA的提取及第一链cDNA的合成采用RNA提取试剂盒提取辣椒总RNA；然后取5μL总RNA，根据转录组测序BnXTH2基因片段克隆BnXTH2完整的ORF(序列为SEQIDNO:1)，推导出编码氨基酸序列(序列为SEQIDNO:2)。二、序列分析经分析发现BnXTH2cDNA长开放阅读框大小为870bp，预测编码289个氨基酸。发现BnXTH2蛋白具有典型的GH16_XET和Glyco_hydro_16结构域，属于XET_C超家族、LamG超家族与SKN1超家族。实施例2本实施例提供了一种BnXTH2的转基因试验方法，具体来说是将BnXTH2基因转导到辣椒中，观察转基因辣椒在低温下的表型变化。1、BnXTH2基因过表达载体的构建S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；1.3)将表达载体pBI121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：PCR片段1μLpBI1214μL5×T4DNALigaseBuffer2μLT4DNALigase1μLddH2O2μL16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；1.5)质粒提取：将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；1.6)转化EHA105：利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5；2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6-BA3mg/L+NAA0.8mg/L+Tim300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA0.7mg/L+Tim300mg/L+Kan100mg/L，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中进行表达，其中，所述BnXTH2基因的完整的开放阅读框如SEQ IDNO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中进行表达，其中，所述BnXTH2基因的完整的开放阅读框如SEQIDNO:1所示，编码氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；
1.1)提取植物整株的总RNA，反转录为cDNA；
1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2-F和BnXTH2-R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；
BnXTH2-F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；
BnXTH2-R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；
1.3)将表达载体pBI121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：



37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；
1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：






16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；
1.5)质粒提取：
将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；
1.6)转化EHA105：
利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；
S2、对辣椒...

【专利技术属性】
技术研发人员：揭雨成，马玉申，揭红东，邢虎成，佘玮，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43