一种砧木改良方法及应用技术

本发明专利技术属于生物嫁接技术领域，涉及一种砧木改良方法及应用，包括：步骤1：合成传递基因；步骤2：将合成传递基因与功能基因构建到载体上；步骤3：以农杆菌侵染方式转基因的烟草为砧木，野生番茄为接穗，进行异源嫁接；步骤4：取嫁接口及不同位置茎段及花，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT‑PCR检测SlZFP2‑tRNA

【技术实现步骤摘要】
一种砧木改良方法及应用
本专利技术属于生物嫁接
，涉及一种砧木改良方法及应用,具体涉及砧穗间长距离传递片段携带功能基因调控接穗农艺性状的方法，更具体涉及的是，通过砧木传递mRNA(信使核糖核酸)片段融合重要农艺性状功能基因遗传转化，进而调控接穗相关性状的技术。
技术介绍
嫁接是园艺作物最主要的无性繁殖方式；在嫁接后，砧木与接穗之间相互作用，会影响树体的生长发育、抗性、开花、果实产量和品质等。在实际的生产中，主要是砧木对接穗的调控，选择适宜的砧木是保障果树栽培成功的关键。优良砧木的选用一般通过实生选种、杂交育种和诱变育种等方式获得，后期再通过无性繁殖，保持砧木品种的优良性状(李天忠等在2008提出；沙广利等在2015年提出)，近年来，也有通过基因工程和DNA(脱氧核糖核酸)分子标记技术等方式改良砧木(韩斌等在2014年提出)。然而，以上方式仅能通过天然的人工筛选获得优良砧木，无法定向应用于实际生产中，同时也存在转基因食品不被公众接受的问题。随着近年来砧穗间传递mRNA的发现，使得砧穗间表型调控机理逐渐清晰，也为定点改良砧木提供理论基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种砧木改良方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：合成传递基因tRNA

【技术特征摘要】
1.一种砧木改良方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：合成传递基因tRNAMet、3×CTCT、3×CTCTt；
所述传递基因tRNAMet的基因序列如序列表序列1所示；
所述传递基因3×CTCT的基因序列如序列表序列2所示；
所述传递基因3×CTCTt的基因序列如序列表序列3所示；
步骤2：克隆促进分枝及提早开花功能基因SlZFP2，将步骤1所述合成传递基因与功能基因共同构建到pCAMBIA1305载体上，用于后续融合表达；
所述功能基因SlZFP2的基因序列如序列表序列4所示；
步骤3：采用农杆菌侵染的方式在烟草中转基因过表达pCAMBIA1305-SlZFP2-tRNAMet、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×CTCT、pCAMBIA1305-SlZFP2-3×CTCTt，以上述转基因烟草为砧木，野生型番茄为接穗，进行番茄/烟草异源嫁接；
步骤4：取嫁接口及嫁接口上下不同位置茎段及花，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-PCR检测SlZFP2-tRNAMet、SlZFP2-3×CTCT、3×CTCTt在番茄/烟草异源嫁接体系中的运输情况；
步骤5：调查不同转基因砧木上野生型番茄的分枝及开花情况。


2.如权利要求1所述的砧木改良方法，其特征在于：步骤1所述传递基因tRNAMet是在原基因tRNAMet序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成；
步骤1所述传递基因3×CTCT是在原基因3×CTCT序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成；
步骤1所述传递基因3×CTCTt是在原基因3×CTCTt序列两端分别添加SalI和BglII酶切位点形成。


3.如权利要求2所述的砧木改良方法，其特征在于：步骤2所述将合成传递基因与功能基因共同构建到pCAMBIA1305载体上的具体步骤如下：
S21、将步骤1所述可传递基因片段tRNAMet、3×CTCT、3×CTCTt与pCAMBIA1305载体共同采用SalI和BglII进行双酶切，形成酶切产物；
S22、将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标片段；
S23、将回收目标片段与pCAMBIA1305载体用T4连接酶连接，构建pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×CTCTt三个可传递载体；
步骤2所述克隆促进分枝及提早开花功能基因SlZFP2的具体步骤如下：
S24、采用CTAB法提取番茄和烟草叶片RNA；
S25、将步骤S24提取的RNA采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒反转录成cDNA；
S26、设计引物克隆番茄SlZFP2基因全长序列，引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。


4.如权利要求3所述的砧木改良方法，其特征在于：步骤3的具体步骤如下：
S31、设计引物，通过PCR扩增将SlZFP2回收产物加酶切位点，引物序列如下：
加入酶切位点SalI的上游引物序列：

GTCGACATGAGTTATGAACCAAACACGG；
加入酶切位点SpeI的下游引物序列：

ACTAGTTTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG；
S32、琼脂糖凝胶电泳检测并回收，与pCAMBIA1305-tRNAMet、pCAMBIA1305-3×CTCT、pCAMBIA1305-3×CTCTt载体分别进行双酶切，采用T4连接酶16℃连接过夜，转入E.coliDH5α感受态细胞中，次日挑取单克隆，摇菌提取质粒；
S33、制备根癌农杆菌GV3101感受态细胞；
S34、转化农杆菌感受态细胞；
S35、转基因烟草；
S36、鉴定烟草转基因阳性株，取阳性苗叶片，用CTAB法提取DNA；
S37、田间嫁接番茄/转基因烟草。


5.如权利要求4所述的砧木改良方法，其特征在于：步骤4的具体步骤如下：
S41、检测功能基因在番茄/烟草田间嫁接体系中的传递性；
具体步骤如下：
S411、将番茄与烟草于田间进行嫁接；
S412、嫁接口愈合，待番茄有新叶长出，去除嫁接口处封口膜，并不断移除老叶使接穗新叶生长；
S413、1个月后，取样番茄的叶片、茎段以及烟草的叶片、茎段，采用液氮研磨，提取RNA后反转录成cDNA；
S414、采用RT-PCR的方式验证GAI和ZFP2基因的传递情况，烟草及番茄中各基因特异性引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：ACCATGACTAGTATGGCTCGGAC；
NtZFP2-F：GCTTATCAAGAAATGAACTTAGCTT；
NtZFP2-R：GCTCAATTCAGTAGTAACAAACCTAG；
SlGAI-F：CTCTAATGGTGCTGTTTCTTCAGG；
SlGAI-R：GGTACTTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，王胜男，王圣元，郝理，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11