双疾病模型小鼠的构建方法技术

本发明专利技术提供的双疾病模型小鼠的构建方法，将衣康酸二甲酯溶于双蒸水中，浓度为1.5mM，喂养小鼠，每2天更换新的水；喂养时间为15‑20天；在自发为1型糖尿病期间，每周强化饮水1次，时间为2天，最终获得双疾病模型小鼠。本发明专利技术模型应能容易检测其运动功能的损伤，包括运动迟缓、肌僵直和静止性震颤等PD的主要症状，成功率高，模型稳定时间长。

【技术实现步骤摘要】
双疾病模型小鼠的构建方法
本专利技术涉及动物模型构建
，具体涉及双疾病模型小鼠的构建方法。
技术介绍
糖尿病已严重威胁人类的生命和健康，是继肿瘤、心血管疾病之后对人类健康危害最严重的慢性非传染性疾病。随着我国社会经济的发展，人们生活水平的提高，饮食结构的变化，我国糖尿病发病率高达9.7%。2010年的调查研究表明，中国目前有超过9240万糖尿病患者，已成为全球糖尿病第一大国。糖尿病动物模型有助于进一步揭示糖尿病的发病机制及干预措施，及各类降血糖药物的测试筛选。动物模型可分为自发性及实验性之分，相较实验性模型而言，自发性模型推广性不强，成本高，而实验性性模型在世界范围内受到广泛欢迎。目前实验性糖尿病模型主要分为手术、化学物质损伤(四氧嘧啶/链脲佐菌素)、催肥、特殊膳食诱导、注射激素、病毒诱导等。手术造模对操作人员要求较高且易发生并发症，病毒诱导造模成功率不高，存在副作用而催肥和膳食诱导周期较长。1型糖尿病病人会伴发帕金森病，目前1型糖尿病合并帕金森病的小鼠模型尚未见报道。本申请便于给临床提供双疾病模型奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供双疾病模型小鼠的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：双疾病模型小鼠的构建方法：（1）选取周龄为3w的雌性NOD/LtJMice小鼠；（2）衣康酸二甲酯溶于双蒸水中，配置含有1.5mM衣康酸二甲酯的双蒸水，喂养小鼠，每2天更换新的双蒸水；（3）喂养时间为15-20天；（4）在自发为1型糖尿病期间，每周强化饮水1次，时间为2天，最终获得双疾病模型小鼠。所述强化饮水是指，重复给予添加含有1.5mM衣康酸二甲酯的双蒸水。现有技术的缺点：1：切除胰腺模型选择性不太好，会引起胰腺其他内分泌激素如生产抑素、胰高血糖素等的缺乏，在病因方面的研究也存在着不足；2：化学物质直接损伤胰岛β细胞容易成功率不高，有一些副作用，目前比较少用。3：近距离的毁损很难把握毁损的程度，模型的成功率很低，其危险性较高，对于试验人员和试验条件有着严格的要求。4：机械损伤造模缺点是切断术后短时间内，损伤的程度不稳定。本专利技术对比现有技术方案，具有以下优点：1：多巴胺能神经元在出生时数量及形态正常，青年时期开始逐渐选择性地减少，减少量超过50％，且容易通过神经化学和神经生理学的方法检测到；2：模型能容易检测其运动功能的损伤，包括运动迟缓、肌僵直和静止性震颤等PD的主要症状；3：有相对较短的疾病周期（如数月），以使药物筛选得以经济、快速地进行，周期短，无需特殊仪器；4：成功率高，模型稳定时间长，便于应用于一般实验室；5：自发性疾病模型是动物自然发生疾病，与人类1型糖尿病有相似之处，可以很好的模仿人类糖尿病临床表现，是较理想的模型。附图说明图1转录组生物信息分析步骤示意图。图2差异表达基因KEGG富集散点图。注释：纵轴表示pathway名称，横轴表示Richfactor，点的大小表示此pathway中差异表达基因个数多少，而点的颜色对应于不同的Qvalue范围。图3运动障碍：不停转圈示意图。图4胰岛素相对含量及血糖相对含量对比图。具体实施方式实施例11、NOD/LtJMice小鼠购自吴氏实验动物（http://www.wssydw.com），周龄为3w雌鼠，随机分成3组：空白对照组、MFB机械损伤组（阳性对照组）、饮水组（实验组），每组12只，适应性喂养一周，28天开始正式实验。衣康酸二甲酯购自上海易恩化学技术有限公司（货号：R000622-25g，含量：98％）。2、MFB机械损伤模型组制备方法：脑立体定位仪上准确定住后，用电线刀深入到MFB所在的部位将其切断；饮水组：2天/换水（含浓度1.5mM的衣康酸二甲酯），时间为15-20天，个体差异不同时间稍有差别；在自发为1型糖尿病期间，每周强化饮水（1次，时间为2天，直至小鼠自发糖尿病症状的出现。3、功能及实验验证：造模完成后进行转录组测序，以MFB机械损伤模型组为阳性对照，进行饮水组小鼠转棒实验、爬杆实验及糖尿病症状及运动障碍表现等的验证。1）、建模后进行转录组生物信息分析：对模型组及阴性对照组进行转录组生物信息分析中，我们发现帕金森该通路下差异表达基因的个数有8个，该通路下所有注释基因的个数高达149个（如下表所示）。差异表达基因KEGG富集列表*其中Parkinson'sdisease指的是帕金森病表格各项含义：①Term：KEGG通路的描述信息；②ID：KEGG数据库中通路的编号③Samplenumber：该通路下差异表达基因的个数；④Backgroundnumber：该通路下所有注释基因的个数；⑤p-Value：富集分析统计学显著水平；⑥CorrectedP-value：多重假设检验校正后的统计学显著水平。2）、差异表达基因KEGG富集散点图针对构建之后的小鼠进行测序分析，最终结果如图2箭头所示，展示了20条富集最显著的通路，并对差异表达基因KEGG富集分析通过散点图进行图形化展示。通过分析我们发现帕金森病相关基因个数qvalue的值接近于零，说明其富集很明显，相关基因个数为8，与阴性对照组相比有统计学意义，P＜0.05。3）、实验室表现（模型验证实验）：A.一般表现：震颤、转弯不停和平衡障碍为其主要表现。B.首发症状：震颤、动作缓慢、步态障碍、肌痛痉挛等。C、饮水组出现类似MFB机械损伤阳性对照组（MFB切断成功率为83％）病理表现：发现约21％的黑质(SN)神经元在一周左右死亡，8周后约67％的细胞死亡。平均SN神经元存活数是25％。D.转棒实验：目的是检测小鼠的运动协调能力。将小鼠置于直径为3cm的旋转杆上，转速调整为30r/min，每次同时测定10只小鼠，每个隔室中1只。记录小鼠从转棒开始转动至掉落转棒所经历的时间，测定时间为1分钟，中间每次休息1分钟，连续测试5次，记录1分钟内掉落的次数。发现模型组掉落转棒所经历的时间为17.24±4.3；阴性对照组为36.57±5.2；掉落次数模型组在8±2次，阴性对照组为4±2，均与对照组相比有统计学意义，P＜0.05。阳性组掉落转棒所经历的时间为19.08±3.5，掉落次数为9±2次。E.爬杆实验：评价小鼠运动协调能力。通过记录小鼠由杆的顶端往下爬到底部（双前爪着地）所需时间。本实验将小鼠放置于一个木制的粗糙的小球上，其下端接有一个表面粗糙、截面为圆形的木棒，木棒下端放置于鼠笼里，当小鼠头朝下方从木球爬至木棒上，用秒表记录此刻的时间为A，当其爬至木棒最下端时，记录此刻的时间为B，那么小鼠爬完整个木棒所用的时间为C，C=A-B，每只小鼠测试俩次，将俩次爬杆的平均时间作为统计指标。结果模型组爬杆的平均时间4.67±1.23，阴性对照组为2.78±0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双疾病模型小鼠的构建方法，其特征在于：所述方法为：/n（1）选取周龄为3w 的雌性NOD/LtJ Mice小鼠；/n（2）衣康酸二甲酯溶于双蒸水中，配置含有1.5mM衣康酸二甲酯的双蒸水，喂养小鼠，每2天更换新的双蒸水；/n（3）喂养时间为15-20天；/n（4）在自发为1型糖尿病期间，每周强化饮水1次，时间为2天，最终获得双疾病模型小鼠。/n

【技术特征摘要】
1.双疾病模型小鼠的构建方法，其特征在于：所述方法为：
（1）选取周龄为3w的雌性NOD/LtJMice小鼠；
（2）衣康酸二甲酯溶于双蒸水中，配置含有1.5mM衣康...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩俊永，陈金烟，王坤，薛士杰，金静君，
申请(专利权)人：福建省医学科学研究院，
类型：发明
国别省市：福建;35