一种实现绵羊FGF5基因精准突变的sgRNA、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种实现绵羊FGF5基因精准突变的sgRNA、试剂盒和应用，属于基因编辑技术领域，所述sgRNA由SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物退火获得；所述试剂盒，包括所述的sgRNA、FGF5

【技术实现步骤摘要】
No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物退火获得。
[0008]优选的，所述正向引物和反向引物的使用浓度分别为8～12μmol/L。
[0009]优选的，所述退火的体系以20μL计，包括以下组分：正向引物1μL，反向引物1μL，退火缓冲液2μL，双蒸灭菌水16μL。
[0010]优选的，所述退火的程序如下：95℃5min，以0.1℃/s的速率降温至21～25℃。
[0011]优选的，所述sgRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]本专利技术提供了一种实现绵羊FGF5基因精准突变的试剂盒，包括所述的sgRNA、FGF5
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单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7；
[0013]所述FGF5
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单链寡核苷酸ssODN的核苷酸序列如SEQ ID No.4。
[0014]优选的，所述Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括pX330质粒。
[0016]本专利技术提供了所述的sgRNA或所述的试剂盒对绵羊FGF5基因进行精准编辑的方法，将所述Cas9 mRNA、sgRNA、FGF5
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单链寡核苷酸ssODN和DNA连接酶IV抑制剂SCR7共同导入绵羊受精卵。
[0017]优选的，所述Cas9 mRNA、sgRNA、FGF5
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单链寡核苷酸ssODN、DNA连接酶IV抑制剂SCR7的导入浓度分别为180～220ng/μL、40～60ng/μL、40～60ng/μL和0.8～1.2μmol/L。
[0018]本专利技术提供了所述的sgRNA或所述的试剂盒在编辑绵羊FGF5基因中的应用。
[0019]本专利技术提供的实现绵羊FGF5基因精准突变的sgRNA的序列能够结合FGF5基因外显子1中的序列，脱靶效应较低，结合本专利技术提供的同源重组模板FGF5
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单链寡核苷酸ssODN，在FGF5基因重组修复时提前引入终止密码子TAA(将C突变为T)，使得FGF5基因翻译的蛋白提前终止，从而达到阻断FGF5基因的表达，实现FGF5基因精准突变。本专利技术提供的sgRNA、试剂盒及方法能够实现绵羊FGF5基因的高效、精准突变，胚胎水平突变率可达78.57％，个体水平突变率可达28.99％。
附图说明
[0020]图1为FGF5基因编辑位置及sgRNA、ssODN序列图；
[0021]图2为胚胎水平FGF5基因编辑形式；序列后的标注为具体的基因编辑形式；
[0022]图3为FGF5基因精准编辑细毛羊编辑形式；序列后的标注为具体的基因编辑形式；
[0023]图4为纯合双等位基因精准突变绵羊FGF5基因(3只)PCR测序峰图；
[0024]图5为杂合单等位基因精准突变绵羊FGF5基因(3只)PCR测序峰图；
[0025]图6为杂合双等位基因精准突变绵羊FGF5基因(12只)PCR测序峰图。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种实现绵羊FGF5基因精准突变的sgRNA，所述sgRNA由SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物退火获得；具体的正向引物序列和反向引物序列如表1所示。
[0027]在本专利技术中，所述正向引物和反向引物的使用浓度分别优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。在本专利技术中，所述退火的体系以20μL计，优选的包括以下组分：正向引物1μL，反向引物1μL，退火缓冲液2μL，双蒸灭菌水16μL。在本专利技术中，所述退火缓冲液优选为10
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Buffer缓冲液(Takara，9151A)。在本专利技术中，所述退火的程序如下：95℃5min，以0.1℃/s的速率降温至21～25℃。本专利技术对所述退火反应的容器及设备没有特殊要求，采用本领域常规的引物退火容器和设备即可。
[0028]在本专利技术中，所述sgRNA靶向的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.3所示；所述sgRNA靶向的核苷酸序列位于FGF5基因外显子1中。
[0029]本专利技术还提供了一种实现绵羊FGF5基因精准突变的试剂盒，包括所述的sgRNA、FGF5
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单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂SCR7。
[0030]在本专利技术中，所述FGF5
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单链寡核苷酸ssODN的核苷酸序列如SEQ ID No.4；所述FGF5
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单链寡核苷酸ssODN作为同源重组模板。在本专利技术中，所述Cas9 mRNA的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.5所示；所述Cas9mRNA编码Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶具有切割双链DNA的活性结构域，使得双链DNA断裂，从而启动同源序列介导的同源重组，实现绵羊FGF5基因的精准编辑。
[0031]在非同源末端连接(NHEJ)修复时，需要DNA连接酶Ⅳ的参与，本专利技术所述DNA连接酶IV抑制剂SCR7，可以抑制DNA酶Ⅳ的活性，从而抑制非同源末端连接(NHEJ)这一细胞修复途径，提高同源序列介导的同源重组修复(HDR)的效率。
[0032]在本专利技术中，所述试剂盒中优选的包括pX330质粒。本专利技术将所述pX330质粒与所述的sgRNA连接、体外转录、纯化得到用于显微导入的sgRNA。
[0033]在本专利技术中，优选的用限制性内切酶BbsI将所述pX330质粒单酶切后与sgRNA连接。在本专利技术中，所述单酶切体系以20μL计，优选的包括以下组分：10
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FastDigest Buffer 2μL，pX330质粒(200ng/μL)5μL，FastDigest enzyme 1μL，ddH2O 12μL。本专利技术中，所述单酶切的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述单酶切的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。本专利技术在所述单酶切后优选的将所述酶切产物进行电泳检测和纯化。在本专利技术中，所述电泳检测优选的采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行；所述纯化优选的采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，本专利技术对所述PCR产物纯化试剂盒的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
[0034]本专利技术将纯化后的pX330质粒单酶切产物与所述的sgRNA连接获得sgRNA重组质粒，以所述sgRNA重组质粒为模板，进行PCR扩增、纯化获得扩增产物。在本专利技术中，所述PCR扩增的体系以50μL计，包括含T7启动子的上游引物(SEQ ID No.6)0.5μL、下游引物(SEQ ID No.7)0.5μL、所述sgRNA重组质粒0.5μL、高保真PCR酶(PrimeSTAR Max Premix)25μL和水23.5μL。在本专利技术中，所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环；最后72℃延伸10min。在本专利技术中，所述P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实现绵羊FGF5基因精准突变的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA由SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物退火获得。2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述正向引物和反向引物的使用浓度分别为8～12μmol/L。3.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述退火的体系以20μL计，包括以下组分：正向引物1μL，反向引物1μL，退火缓冲液2μL，双蒸灭菌水16μL。4.根据权利要求3所述的sgRNA，其特征在于，所述退火的程序如下：95℃5min，以0.1℃/s的速率降温至21～25℃。5.根据权利要求1～4任意一项所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。6.一种实现绵羊FGF5基因精准突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述的sgRNA、FGF5
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单链寡核苷酸ssODN、Cas9 mRNA和DNA连接酶IV抑制剂S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文蓉，刘明军，刘晨曦，彭新荣，张雪梅，李忠慧，贺三刚，刘金瑞，张宁，玛依拉，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：