肝-胆-胰组织和其制备方法技术

本文公开肝‑胆‑胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)组合物，以及制备和使用肝‑胆‑胰类器官组合物的方法。所述公开的组合物可具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能，和内分泌胰组织功能。还公开使用所述肝‑胆‑胰类器官组合物治疗个体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝-胆-胰组织和其制备方法相关申请的交叉引用本申请要求2019年7月26日提交的题为“从在人体内的前肠道-中肠道边界建模肝-胆-胰器官发生”的62/703,559的优先权和权益，其内容出于所有目的以其全文并入。
技术介绍
器官发生是一个复杂且互连的过程，由多种边界组织相互作用统筹1-7。然而，迄今为止，尚不清楚各个相邻组分如何协调以建立完整的多器官结构。因此，干细胞培养中的多器官整合已为未解决的关键挑战。具体来说，获得具有多于一种组织类型的结构上和功能上整合的类器官是所属领域中未满足的需求。更特别的是，由于技术复杂性，肝-胆-胰(HBP)系统的模式化和平衡的器官发生尚未在组织培养中成功建模，阻碍详细的机理研究16、17。本公开试图解决在所属领域中的一个或多个前述需要。
技术实现思路
本文公开肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)组合物，以及制备和使用肝-胆-胰类器官组合物的方法。公开的组合物可具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能，和内分泌胰组织功能。还公开使用肝-胆-胰类器官组合物治疗个体的方法。附图说明所属领域的技术人员将理解，下文描述的附图仅用于说明性目的。附图不旨在以任何方式限制本教示内容的范围。图1A-1G。边界类器官生成多内胚层结构域。1A。用于从iPSC建立肝-胆-胰(HBP)类器官(“HBPO”)的示意性概述。人PSC分化成前部或后部肠道细胞。将细胞解离成单个细胞并重新聚集以形成前部/后部肠道球体，并且在基质胶中生成前部-后部边界类器官。基质胶包埋从边界类器官开始多器官规格和内陷。1B。经由SOX2+前部和CDX2+后部肠道球体的融合的边界类器官的生成。SOX2和CDX2的表达通过呈红色的SOX2、呈绿色的CDX2和呈白色的DAPI进行整体免疫染色，流式细胞术检测每个群的百分比作为进样口数，并通过qPCR证实。数据为平均值±标准差；n＝3个独立实验。未配对的双尾学生t检验。1C。从第8天到第11天人iPSC衍生的前部和后部类器官混合体的示踪。上排：亮场。中排：呈红色的SOX2、呈绿色的PDX1、呈蓝色的CDX2和呈白色的DAPI的整体免疫染色。下排：呈蓝色的CDX2、呈绿色的HHEX、呈红色的PDX1和呈白色的DAPI的整体免疫染色。箭头：PDX1和HHEX阳性区域。1D。在对PDX1染色的边界类器官免疫荧光的每个区中检测到PDX1阳性细胞的频率。1E。PDX1阳性细胞在每个边界类器官中的位置。Y轴示出与DAPI染色的总细胞数相比，在每个区中PDX1阳性细胞的百分比。f。在第11天以各种组合(前部-后部(AP)(n＝4)、前部到前部(AA)(n＝3)和后部-后部(PP)(n＝3))融合的类器官的HHEX和PDX1阳性细胞的百分比。Y轴示出与DAPI染色的总细胞数相比，性细胞的百分比。数据为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01；单向方差分析。g。从第8天(D8)到第12天(D12)，随时间过程的边界类器官的转录组学表征。解剖、分离前部(A)、边界(B)和后部(P)结构域，并将其应用于RNA测序，如左代表性图像指示(前部肠道球体通过GFP标记，并且后部肠道球体通过RFP标记)。前部、边界和后部结构域分别示出报告的前部前肠、肝脏/胆/胰腺原基和中/后肠道标志物的基因集的丰富31,32。比例尺50μm(1B)，100μm(1C)，50μm(1G)。图2A-2I。在没有诱导因子的情况下，从边界类器官自行出现肝-胆-胰祖细胞。2A。通过CRISPR-Cas9基因编辑系统生成PROX1-tdTomato报告基因系。2B。从第9天到第11天，在建立的PROX1报告基因iPSC中的PROX1-tdTomato表达。2C。每个类器官中的PROX1-tdTomato阳性区。评估AP、AA和PP的组合。在AP组合中，在边界类器官的细胞膜中证实tdTomato表达。2D。小鼠肝脏原基外植体(Prox1::GFP)和人iPSC衍生的边界类器官(PROX1::m-tdTomato)的肝内陷。2E。第13天，在E8.75小鼠胚胎和边界类器官中的PROX1免疫染色。2F。边界类器官的转录组学表征。解剖、分离前部、边界和后部结构域，并且将其应用于RNA测序。热图示出与选自GO术语类别和KEGG途径类别的FGF、BMP、Hedgehog、NOTCH和RA信号途径有关的下游基因表达。热图通过无偏层次聚类分为8个详细的组(C1-C8)。在B中示出高表达基因的独特表达模式的C6指示RA下游基因集比其它丰富。2G。在视黄酸、BMS493、R-75251或WIN18446的三天培养物下第11天，HHEX、PDX1、SOX2和CDX2的基因表达。2H。在来自原始前部或后部肠道球体的上皮或间充质细胞中RA信号途径有关基因的基因表达分析。使用RFP或GFP标记的iPSC分化每个肠道球体，并且在边界形成之后解离成单个细胞。通过RFP或GFP表达执行前部/后部分离，而通过EpCAM表达执行上皮/间质分离。2I。移植的边界类器官的默认发育潜力。中图示出H&E染色和免疫组织化学分析，而右图示出免疫荧光分析。比例尺50μm(2B)，200μm(2D)，100μm(2E)，100μm(2I)。图3A-3O。建模人类肝-胆-胰器官发生。3A。从HBP类器官解剖PROX1阳性区域的图示以及解剖前后的图像。3B。优化培养系统的方法：1)浮选，2)包埋到基质胶中，3)包埋到基质胶中，并与来自D13的Transwell一起培养，4).将其解剖，包埋到Matrigel中，并与D13的Transwell一起培养。左图示出内陷或支化类器官的分类。3C。从第13天起的2天内，边界类器官的形态发生。3D在30天的空气-液体界面培养系统中，来自边界类器官的PROX1解剖组织的形态发生改变。3E。第37天类器官的立体显微镜图像。3F。边界类器官具有支化出假定的胰结构域的tdTomato表达肝胆组织，类似于培养的小鼠E10.5衍生肝-胆-胰腺。左：在4天期间培养的小鼠胚胎组织，右：第90天的PROX1-tdTomato报告基因iPSC。3G。右：与肠连接的内陷肝脏\胆管和胰腺的图示。左：在D90边界组织中的H&E。3H-3I。CK19\PDX1\PROX1\SOX9和NGN3以及α-SMA和SOX17(3H)以及AFP、EpCAM和α-SMA(3I)的组合的免疫染色。3J、3K。PDX1、NKX6.1和GATA4以及DBA、PDX1和PROX1(3K)的整体染色。3L-3N。NKX6.1和HNF1B(3L)、淀粉酶和GATA4(3M)以及淀粉酶和CCKAR(3N)的免疫染色。3O。在假定胆结构中的CCK治疗响应。3P。激素诱导外分泌胰腺结构域的分泌功能。在3天-CCK之前和之后边界组织中的淀粉酶的酶联免疫吸附测定。比例尺，100μm(a)，100μm(3B)，100μm(3C)，200μm(3D)，1mm(3E)，200μm(3F)，200μm(3G)，200μm(3H)，200μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)，其中所述HBPO具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能和内分泌胰组织功能。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180726 US 62/703,5591.一种肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)，其中所述HBPO具有两种或更多种选自以下的功能：肝组织功能、胆组织功能、外分泌胰功能和内分泌胰组织功能。


2.根据权利要求1所述的HBPO，其中所述多器官三维类器官组合物包含前部区域、后部区域和边界区域，其中所述边界区域表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)和造血表达的同源盒蛋白(HHEX)。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的HBPO，其中所述HBPO包含胆管组织和胰组织。


4.根据权利要求3所述的HBPO，其中所述胆管组织和所述胰组织连接。


5.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO包含肝脏细胞、胰腺细胞、胆管细胞和肠细胞。


6.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官包含内皮细胞。


7.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官包含间充质细胞。


8.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO包含内胚层和中胚层。


9.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO具有支化结构。


10.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官表达功能外分泌标志物，优选地淀粉酶，和内分泌标志物，优选地胰岛素。


11.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述类器官响应于激素，优选地响应于胆囊收缩素(CCK)分泌淀粉酶。


12.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述组合物基本上不含粘膜下腺、过渡区域、血管系统、免疫细胞或粘膜下层中的一种或多种。


13.根据前述权利要求中任一项所述的HBPO，其中所述HBPO通过扩增一个或多个前体细胞获得。


14.一种制备肝-胆-胰类器官(“HBPO”或“HBP类器官”)的方法，其包含
使第一定形内胚层与Wnt信号传导途径激活剂、FGF信号传导途径激活剂和BMP信号传导途径抑制剂接触以形成前部肠道球体；
使第二定形内胚层使Wnt信号传导途径激活剂和FGF信号传导途径激活剂接触以形成后部肠道球体；
使所述前部肠道球体与所述后部肠道球体接触，直到所述前部肠道球体和所述后部肠道球体融合以形成具有前肠道-中肠道边界的边界类器官；和
培养具有所述前肠道-中肠道边界的所述边界类器官以形成所述HBPO；
其中所述HBPO包含胆组织和胰组织。


15.根据权利要求16所述的方法，其中所述HBPO包含肝脏组织、胰组织、胆管组织和肠组织。


16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述前部肠道球体包含表达SRY-盒2(SOX2)的细胞。


17.根据权利要求14到16中任一项所述的方法，其中所述前部肠道球体基本上不含胰和十二指肠同源盒1(PDX1)表达细胞。


18.根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞。


19.根据权利要求14到18中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体包含表达尾侧型同源盒2(CDX2)的细胞。


20.根据权利要求14到19中任一项所述的方法，其中所述边界类器官包含表达胰和十二指肠同源盒1(PDX1)的细胞、表达造血表达的同源盒蛋白(HHEX)的细胞，和表达Prospero有关的同源盒1(PROX1)的细胞。


21.根据权利要求14到20中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体表达CDX2。


22.根据权利要求14到21中任一项所述的方法，其中所述边界类器官包埋到形态发生因子中，优选地基底膜基质，更优选地基质胶。


23.根据权利要求14到22中任一项所述的方法，其还包含从所述边界类器官切除PROX1阳性区域，并且培养所述切除的边界类器官以形成内陷上皮和支化结构。


24.根据权利要求14到23中任一项所述的方法，其中所述HBPO在旋转下培养。


25.根据权利要求14到24中任一项所述的方法，其中将所述HBPO移植到哺乳动物(如非人类哺乳动物)中一段时间，以增加所述HBPO的生长和成熟，优选地其中移植所述HBPO以拯救器官功能障碍。


26.根据权利要求14到25中任一项所述的方法，其中前部肠道球体的特征在于SRY-盒2(SOX2)表达。


27.根据权利要求14到26中任一项所述的方法，其中所述后部肠道球体的特征在于尾侧型同源盒2(CDX2)表达。


28.根据权利要求14到27中任一项所述的方法，其中所述融合的前部肠道球体和所述后部肠道球体包含胆-胰原基，其特征在于SOX2、CDX2、HHEX和PDX1的表达，并且其中PDX1表达局限于所述融合的前部肠道球体和所述后部肠道球体的边界区域。


29.权利要求14到28中的任一项所述的方法，其中所述多器官三维类器官包含内胚层和中胚层。


30.根据权利要求14到29中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层衍生自选自以下的前体细胞：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞、中胚层细胞、定形内胚层细胞、后...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，小池博之，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，
类型：发明
国别省市：美国;US