一种芽孢杆菌属绝对定量的探针、方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种芽孢杆菌属绝对定量的探针、方法、试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明专利技术的芽孢杆菌属微生物定量探针和试剂盒，能够实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测，用于检测和芽孢杆菌微生物定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明专利技术所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明专利技术的探针、检测试剂盒用于芽孢杆菌属微生物定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种芽孢杆菌属绝对定量的探针、方法、试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种芽孢杆菌属微生物绝对定量方法、试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。
技术介绍
芽孢杆菌(Bacillus)广泛分布在传统发酵食品酿造系统中，参与发酵过程的多种底物的代谢和产物和合成，例如大分子蛋白的降解、多糖的降解以及吡嗪类化合物的合成等。因此，芽孢杆菌微生物的规律性演替是稳定食品质量的基本保证。目前，芽孢杆菌的定量主要为荧光定量PCR法，依靠荧光定量PCR仪，但价格昂贵、操作过程较为复杂。为实时跟踪芽孢杆菌再发酵过程中的动态变化规律，促进产品的稳定和升级，非常有必要提供一种简便、快速、准确的定量方法。G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。目前，基于G四链体/血红素模拟酶活检测的原理有被用于微生物的特异性检测的报道；例如文献WangY,LiX,XiD,WangX.VisualdetectionofFusariumproliferatumbasedonasymmetricrecombinasepolymeraseamplificationandhemin/G-quadruplexDNAzyme.RscAdvances2019；9:37144-37147.中，使用了不对称特异性引物(上游引物添加G四链体的反向序列修饰，下游不修饰)，该方法只能适用于样本中特定细菌Fusariumproliferatum的检测，无法实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测；此外，该文献利用该不对称特异性引物进行检测时，是在PCR体系中添加不同浓度的上下游引物(上游引物浓度低，下游引物浓度高)，通过重组聚合酶扩增(RPA)扩增形成双链产物，随着PCR反应的进行，上游引物被消耗殆尽，下游引物使用新合成的双链DNA为模板扩增，从而形成带有G四链体末端的单链DNA，从而使用G四链体/血红素模拟酶活检测检测样本中的Fusariumproliferatum。但该定量方法依然需要PCR步骤产生G四链体，而PCR过程依然需要高额PCR设备以及严格的操作环境。
技术实现思路
本专利技术的一种用于芽孢杆菌微生物绝对定量的方法、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测；(2)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(4)现有定量方法操作繁琐等。本专利技术的第一个目的是提供一组探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQIDNO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)或SEQIDNO.3所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)。在一种实施方式中，淬灭探针序列为SEQIDNO.2所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)或SEQIDNO.4所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTCCCAA)。在一种实施方式中，信号探针序列为SEQIDNO.1所示，淬灭探针序列为SEQIDNO.2所示。或者SEQIDNO.3所示，淬灭探针序列为SEQIDNO.4所示。本专利技术的第二个目的是提供芽孢杆菌微生物定量方法，所述方法包括使用本专利技术的探针。所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针(序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3)，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针(序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4)与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征芽孢杆菌微生物的生物量。在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与芽孢杆菌微生物的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的芽孢杆菌微生物的生物量。在一种实施方式中，所述方法为相对定量方法，还包括：检测多个样品，根据不同样本检测得到的过氧化氢酶活性的相对比值确定该多个不同样本中芽孢杆菌微生物的生物量的相对值。在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品，或者肠道、土壤、水体等环境样本；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。在一种实施方式中，所述样品为发酵食品或者取自发酵食品发酵过程中的样品。在一种实施方式中，所述发酵食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品等。在一种实施方式中，所述待测样品中DNA发生解链，是采用高温方式进行。可选地，是将待测样品在高于90℃温度下处理。可以是金属浴、水浴、烘箱、保温仪等任意一种能提供对应温度的环境。在一种实施方式中，所述解链是在缓冲液中进行。可选地，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。在一种实施方式中，所述过量是指，加入量高于能与待测样本的目标核苷酸片段全部结合形成双链时所需要的信号探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。在一种实施方式中，所述过量是指，超过1010个拷贝的信号探针。在一种实施方式中，所述信号探针与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，是在50-60℃温度范围下进行的。在一种实施方式中，所述足量是指，加入量足以与全部未结合的信号探针形成双链时所需要的淬灭探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。在一种实施方式中，所述足量是指，信号探针的双倍量。在一种实施方式中，所述加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，是在能使淬灭探针与未结合的信号探针形成双链的温度下进行；本领域技术人员可以结合本领域常识来确定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组探针，其特征在于，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列包括SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.3所示的序列；淬灭探针序列包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一组探针，其特征在于，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列包括SEQIDNO.1所示或SEQIDNO.3所示的序列；淬灭探针序列包括SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示的序列。


2.检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的信号探针和淬灭探针。


3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、H2O2。


4.一种芽孢杆菌微生物定量方法，其特征在于，所述方法使用了权利要求1所述的探针，或者权利要求2-3任一所述的检测试剂盒。


5.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征芽孢杆菌微生物的生物量。


6.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述方法为绝对定量或者相对定量；可选地，所述方法为绝对定量时，还包括：建立过氧化氢酶活性或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，与芽孢杆菌微生物的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴群，徐岩，杜如冰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32