一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法技术

一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括水产养殖样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；14种标准品构建过程：(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物；(3)PCR产物一代测序，并与NCBI数据库比对，比对确定是相对应的基因再进行下一步；(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆，通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；(5)对质粒插入片段进行一带测序，跟(3)的序列进行比对，吻合即为该基因的质粒标准品。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法
本专利技术属于检测
，具体涉及一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法。
技术介绍
随着水产养殖产业的飞速发展，抗生素作为治疗和控制疾病暴发重要手段，被作为养殖药物或者混合饲料被大量投入使用。不仅降低了抗生素的效用，还促进水产养殖环境和水产品体内产生抗性细菌及抗生素抗性基因，目前，水产养殖环境已被证实是抗生素抗性基因的重要储库。其中，四环素类抗生素作为一类具有广谱抗菌活性的人畜共用抗菌剂，被广泛用于水产养殖环境。四环素类抗性基因在水产养殖环境具有极高检出率，并且亚型最为丰富。水产养殖环境中抗生素抗性污染的传播、扩散往往可能比抗生素本身的危害更大，可通过食物链给人类健康带来更为直接的危害，建立水产养殖环境中典型抗生素抗性基因的分析检测手段势在必行。但抗生素抗性基因关注较少，目前尚未建立统一的检测方法来测定水产养殖环境中的抗生素抗性基因。但是要实现水产养殖环境的全方位的监测，对于通量要求比较高。而且开放的水产养殖环境核酸提取量比较少，所以迫切需要一种技术及能高通量的监测，又对样本的总量要求比较低的一种技术和方法。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术提供了一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；沉积物直接采集，然后冷冻保存；水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；优选的，所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchipqPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；所述定量检测方法为qPCR法；所述定量检测方法的100nL反应体系为：1×LightCycler480SYBRGreenIMaster500nMeachprimerDNAtemplate2ng/μL优选的，所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；优选的，所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数；优选的，所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下：优选的，14种所述标准品构建过程如下：(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物；(3)PCR产物一代测序，并与NCBI数据库比对，比对确定是相对应的基因再进行下一步；(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆，通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；(5)对质粒插入片段进行一带测序，跟(3)的序列进行比对，吻合后即为该基因的质粒标准品；优选的，14种所述标准品分别用无核酸水按照1/10依次梯度稀释5个标准液，然后用smartchipqPCR绘制标准曲线；与现有技术相比，本专利技术专利具有如下显著特征和优点：1、检测通量高，对于14个四环素基因，本实验一次可检测107个样本，并进行了3个技术重复；2、样本用量少，由于水产养殖环境样本，特别是水产品的肠道内微生物含量少，提取过程困难，提取的核酸总量在传统的qPCR设备上很难进行14个基因的检测，并且做重复实验；3、对于四环素的抗性检测覆盖面积广，基本上覆盖了目前数据库中四环素抗性相关的基因，便于全方位的监测四环素在水产养殖环境中的动向及上升下降。4、每个基因各构建一个标准质粒，实现准确的拷贝数定位，便于后续环境监测的推广。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。附图说明图1为14个基因对于的标准曲线；图2为107个样本的质检结果；图3为绝对拷贝数的自动化计算脚本。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体，进一步阐明本专利技术。本专利技术提供了一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；沉积物直接采集，然后冷冻保存；水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；优选的，所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchipqPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；所述定量检测方法为qPCR法；所述定量检测方法的100nL反应体系为：1×LightCycler480SYBRGreenIMaster500nMeachprimerDNAtemplate2ng/μL优选的，所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；优选的，所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数；优选的，所述四环素类抗生素抗性基因的引物序列如下：优选的，14种所述标准品构建过程如下：(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；(2)切胶回收耐药基因的普通PCR产物；(3)PCR产物一代测序，并与NCBI数据库比对，比对确定是相对应的基因再进行下一步；(4)将回收的普通PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆，通过质粒携带的抗性基因筛选出阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；(5)对质粒插入片段进行一带测序，跟(3)的序列进行比对，吻合后即为该基因的质粒标准品；优选的，14种所述标准品分别用无核酸水按照1/10依次梯度稀释5个标准液，然后用smartchipqPCR绘制标准曲线；案例一、标准质粒构建第一步、基因选择四环素抗生素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括四环素抗生素抗性基因，水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，/n所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；/n所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；/n所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：/n水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；/n沉积物直接采集，然后冷冻保存；/n水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；/n所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchip qPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；定量检测方法为qPCR法；定量检测方法的100nL反应体系为：/n1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster/n500nM each primer/nDNA template 2ng/μL/n所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s；60℃，30s}40cycles+溶解曲线；/n所述数据处理是通过python编写的自动化脚本计算每个样本的每个基因的绝对拷贝数。/n...

【技术特征摘要】
1.一种高通量水产养殖抗生素抗性基因的定量检测方法，包括四环素抗生素抗性基因，水产养殖环境样本的采集，处理、核酸抽提、标准品构建及标准曲线绘制、高通量qPCR检测和数据处理，其特征在于，
所述四环素抗生素抗性基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetH、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetS、tetW、tetX、tetBP等14种；
所述水产养殖环境样本包括水体、沉积物和水产品排泄物；
所述水产养殖环境样本的处理具体包括如下：
水体样本通过0.22-0.28μm混合滤膜过滤，然后将混合滤膜冷冻保存；
沉积物直接采集，然后冷冻保存；
水产品排泄物是采集水产品的肠道，然后冷冻保存；
所述高通量qPCR检测的平台为wafergen平台的smartchipqPCR仪，所述smartchipqPCR仪一次可运行5184个qPCR反应，有14种引物和样本搭配模式；定量检测方法为qPCR法；定量检测方法的100nL反应体系为：
1×LightCycler480SYBRGreenIMaster
500nMeachprimer
DNAtemplate2ng/μL
所述定量检测方法的反应条件为：预变性95℃，10min；{95℃，30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：那广水，张鸿，高会，李瑞婧，金帅辰，李西清，王璇，赵琨，
申请(专利权)人：国家海洋环境监测中心，安徽微分基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21