本发明专利技术涉及一种生产4‑羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α‑酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA的表达进行弱化。该菌株经过24‑48h发酵，4‑羟基异亮氨酸产量达到32.5‑62.4g/L，整个发酵过程中未检测到L‑异亮氨酸，表明L‑异亮氨酸被完全转化。该方法采用的发酵工艺简单，无需添加前体物L‑异亮氨酸和α‑酮戊二酸，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。
【技术实现步骤摘要】
一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用
：本专利技术涉及一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。
技术介绍
：4-羟基异亮氨酸是L-异亮氨酸的一种羟基化物。4-羟基异亮氨酸是传统降血糖药物葫芦巴种子中的主要活性物质，具有4-羟基异亮氨酸促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，降血糖，降血脂的作用，在治疗糖尿病方面有良好应用前景。4-羟基异亮氨酸主要的生产方法有提取法、化学合成法，酶催化法和微生物发酵法。目前工业化生产主要采用葫芦巴种子提取法，然而每提取1.0g的4-HIL需要消耗6.7kg的葫芦巴种子，产量低且原料成本高，工艺复杂。化学合成法和酶催化法需要昂贵的底物和辅酶，反应条件苛刻，易产生有毒副产物，影响后续的医疗使用。相比之下，微生物发酵法生产效率高，成本低廉且已成功地用于多种天然产品的工业化生产,将会是现有提取法的一种理想的替代方法。张志钧等(201811611461.7)利用表达有异亮氨酸双加氧酶的大肠杆菌静息细胞作为酶源，通过添加前体物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，4-羟基异亮氨酸产量28.3g/L。饶志明等(201910120166.X)采用相同的方法利用枯草芽孢杆菌工程菌，使得4-羟基异亮氨酸产量达到27.8g/L。张文丽等(Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶重组大肠杆菌全细胞催化合成)采用含异亮氨酸双加氧酶的大肠杆菌静息细胞作为酶源，利用底物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，4-羟基异亮氨酸产量达到58.8g/L。上述方法不足之处在于，需要添加L-异亮氨酸和α-酮戊二酸两种前体物，大大增加了生产成本。史锋等(201910248263.7)将异亮氨酸双加氧酶编码基因导入能够生产谷氨酸棒杆菌，在添加前体物α-酮戊二酸的条件下，可生成4-羟基异亮氨酸16.35g/L，发酵周期为144h。该方法不足之处在于，需要添加前体物α-酮戊二酸、4-羟基异亮氨酸产量低、发酵周期长。孟静等(两阶段溶氧控制及FeSO4添加对谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的影响)利用谷氨酸棒杆菌构建了需添加L-异亮氨酸和α-酮戊二酸的4-羟基异亮氨酸生产菌株，该菌能够利用葡萄糖直接发酵合成4-羟基异亮氨酸，经64h发酵，4-羟基异亮氨酸产量达到43.4g/L。然而该方法的发酵产量较低，发酵周期偏长。
技术实现思路
：为解决上述需要添加前体物L-异亮氨酸和(或)α-酮戊二酸、4-羟基异亮氨酸产量低、发酵周期长、生产成本高等瓶颈问题，本专利技术提供一种产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及采用该菌直接发酵生产4-羟基异亮氨酸的方法。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案之一是：提供一株4-羟基异亮氨酸高产菌株，所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA(BAA35392.1)的表达进行弱化；进一步地，所述异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；进一步地，通过将sucA原启动子替换为BBA_J23114弱启动子进行弱表达；进一步地，所述BBA_J23114弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。所述宿主菌TUIE03已公开于中国专利ZL2019105529156。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案之二是：提供构建上述4-羟基异亮氨酸基因工程菌的方法，包括如下步骤：(1)重组质粒pST-ido的构建以SEQIDNO.1所示的ido基因片段为模板，利用引物ido-1和ido-2扩增ido基因片段，PCR产物经EcoRI和HindIII双酶切后经T4连接酶连接至经相同酶切的pSTV28质粒后获得pST-ido；(2)sucA弱化菌株HIL02的构建以野生型大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物sucA-1/sucA-2及sucA-3/sucA-4扩增sucA启动子的上下游同源臂，然后利用重叠PCR获得sucA启动子上游同源臂、启动子BBA_J23114和sucA启动子下游同源臂的融合片段UPsucA-BBA_J23114-DPsucA；将RB-1/RB-2退火后连接至pGRB，获得pGRB-sucA；将pGRB-sucA和UPsucA-BBA_J23114-DPsucA电转化至含pREDcas9的TUIE03，经筛选获得sucA弱化菌株HIL02；(3)4-羟基异亮氨酸生产菌株HIL03的构建将步骤(1)获得的pST-ido转化至HIL02，经筛选获得HIL03。本专利技术解决上述问题所采用的技术方案之三是：菌株HIL03在生产4-羟基异亮氨酸中的应用；进一步地，采用菌株HIL03发酵生产4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：①种子培养：将本专利技术所述的大肠杆菌基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-40％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-800rpm，35℃培养6-8h。②发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤①的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32℃-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-50％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期24-48h，产量为32.5-62.4g/L；③发酵液中L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：AgilentC18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。所述种子培养基成分为：35g/L葡萄糖，0.5-12g/L(NH4)2SO4，5-10g/L酵母粉，1-6g/L胰蛋白胨，3-10g/L玉米浆干粉，2-4g/LKH2PO4，10-50mg/LFeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。所述发酵培养基成分为：10-20g/L葡萄糖，1-5g/L(NH4)2SO4，2-8g/L酵母粉，0.2-1g/L胰蛋白胨，2-5g/L玉米浆干粉，2-5g/LKH4PO4，1-4g/LMgSO4·7H2O，5-15mg/LFeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。有益效果：(1)本专利技术以L-异亮氨酸高产菌TUIE03为出发菌株，利用代谢工程手段，通过引入4-羟基异亮氨酸合成途径并弱化α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基转录构建了生产4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌基因工程菌。于5L发酵罐进行分批补料发酵，24h时发酵强度最高，为1.83g/L/h，此时4-羟基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种4-羟基异亮氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA的表达进行弱化。/n
【技术特征摘要】
1.一种4-羟基异亮氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA的表达进行弱化。
2.如权利要求1所述的一种4-羟基异亮氨酸生产菌株，其特征在于，所述异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的一种4-羟基异亮氨酸生产菌株，其特征在于，通过将sucA原启动子替换为BBA_J23114弱启动子进行弱表达；
所述BBA_J23114弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。
4.权利要求1-3任意所述菌株在生产4-羟基异亮氨酸中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张成林，韩世宝，郑颖楠，林蓓蓓，徐皓然，李洋，陈宁，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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