氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法技术

本发明专利技术涉及氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法。本发明专利技术公开了一株以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学或者代谢工程领域。本发明专利技术将4‑香豆酰辅酶A连接酶基因4cl、二聚酮合酶基因dcs、姜黄素合成酶基因curs3以及乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1组成合成途径转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，并对合成途径进行模块划分及优化，得到了产量最优的一株工程菌。通过对发酵条件的优化，最终使得该菌株在以对氨基肉桂酸为底物发酵48h后，氨基双去甲氧基姜黄素的产量达到33mg/L。本发明专利技术为高活性氨基双去甲氧基姜黄素的工业化生产和应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
本专利技术属于代谢工程领域，涉及一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；尤其涉及一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的高产菌株构建方法以及发酵条件优化。
技术介绍
姜黄素类化合物是中药姜黄中具有药理作用的主要活性成分，根据其结构的不同，主要分为三种：姜黄素(curcumin，C21H20O6)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin，C20H18O5)以及双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin，C19H16O4)。姜黄素类化合物具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗心脑血管活性，另一方面姜黄素在食品工业中也被广泛用作于食品添加色素。因此该类化合物具有广阔的应用前景。根据前期课题组的研究，一种氨基双去甲氧基姜黄素(NH2-bisdemethoxycurcumin，NBMC)具有更高于天然双去甲氧基姜黄素的抗炎能力。该化合物在此之前没有相关报道，因此不能使用天然的植物提取方法来获得。目前关于姜黄素类化合物的微生物发酵方法已逐渐成为该类化合物获取的主要研究对象，具有一定的研究基础。而氨基双去甲氧基姜黄素的获取，在一定程度上也为后续获得氨基姜黄素等其他衍生产物提供了可能。本专利技术是以对氨基肉桂酸为底物，通过对合成途径进行模块划分及优化，使其获得较高的氨基双去甲氧基姜黄素的产量，并通过发酵条件的优化进一步提升了最终的产量，为后续的的大规模工业化生产提供了研究基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法；本专利技术提供了一株高产氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，并通过发酵条件的优化进一步提高菌株的产量，为其工业化生产奠定了基础。本专利技术的目的是通过以下技术手段实现的。第一方面，本专利技术提供一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。作为本专利技术的一个实施方案，通过同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达。所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：pRSFDuet-1(拷贝数>100，Kan)、pETDuet-1(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。作为本专利技术的一个实施方案，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1在同一个质粒上。作为本专利技术的一个实施方案，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在pCDFDuet-1质粒或pACYCDuet质粒上。第二方面，本专利技术提供了一种所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；(2)通过酶切酶连方法构建4CL表达质粒：pCDF-4CL和pACYC-4CL；(3)通过酶切酶连方法构建DCS和CURS3表达质粒：pRSF-DCS-CURS3、pET-DCS-CURS3、pCDF-DCS-CURS3和pACYC-DCS-CURS3；(4)通过酶切酶连方法构建AccBC和DtsR1表达质粒：pRSF-AccBC-DtsR1、pET-AccBC-DtsR1、pCDF-AccBC-DtsR1和pACYC-AccBC-DtsR1；(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同抗性进行组合，各组合分别电转化入MG1655(DE3)感受态细胞中；(6)对应重组质粒的抗性，对长出的菌落进行筛选，并进一步利用PCR验证重组菌株的正确性。作为本专利技术的一个实施方案，步骤(5)中，所述组合包括：pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pET-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pACYC-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pCDF-4CL、pACYC-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pCDF-DCS-CURS3和pRSF-AccBC-DtsR1的组合，pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合，以及pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pET-AccBC-DtsR1的组合。作为本专利技术的一个实施方案，取pACYC-4CL、pRSF-DCS-CURS3和pCDF-AccBC-DtsR1的组合电转化入MG1655(DE3)感受态细胞中，获得重组菌株。作为本专利技术的一个实施方案，所述方法还包括对构建得到的重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。第三方面，本专利技术提供一种利用所述大肠杆菌工程菌发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素的方法，将所述大肠杆菌工程菌接种到100mLLB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG和0.5mM的对氨基肉桂酸，在25℃、220rpm条件下继续培养36h。第五方面，本专利技术对构建得到的12株重组菌进行氨基双去甲氧基姜黄素的检测，筛选出产量最优的工程菌。该菌株为大肠埃希氏菌EscherichiacoliHXJE109，保藏编号为CGMCCNO.20984。第六方面，利用所述的产量最优工程菌，对其进行发酵条件优化，发酵生产氨基双去甲氧基姜黄素；具体步骤为：将上述工程菌接种到1LLB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养至OD600≈0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃、220rpm条件下诱导5h。将菌液在5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至100mL含有0.5mM对氨基肉桂酸的新鲜LB培养基中，25℃继续培养48h。本专利技术中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。/n

【技术特征摘要】
1.一种以对氨基肉桂酸为底物合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，其特征在于，在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达了合成途径中所需的关键酶：4-香豆酰辅酶A连接酶4CL、二聚酮合酶DCS、姜黄素合成酶CURS3以及乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，编码所述4-香豆酰辅酶A连接酶4CL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述二聚酮合酶DCS的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码所述姜黄素合成酶CURS3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，编码所述乙酰辅酶A羧化酶AccBC和DtsR1的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。


3.根据权利要求1和2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，同时使用3个载体对所述5条基因进行共表达；所述载体在以下4个拷贝数不同、抗性不同的载体中随机组合：pRSFDuet-1(拷贝数>100，Kan)、pETDuet-1(拷贝数～40，Amp)、pCDFDuet-1(拷贝数20-40，Spe)和pACYCDuet(拷贝数10-12，Chl)。


4.根据权利要求3所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在一个质粒上；二聚酮合酶基因dcs和姜黄素合成酶基因curs3在同一个质粒上；乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1在同一个质粒上。


5.根据权利要求4所述大肠杆菌工程菌，其特征在于，4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl单独在pCDFDuet-1质粒或pACYCDuet质粒上。


6.一种如权利要求1-5中任一项所述的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述关键酶的5条基因进行大肠杆菌密码子优化并全合成；
(2)通过酶切酶连方法构建4CL表达质粒：pCDF-4CL和pACYC-4CL；
(3)通过酶切酶连方法构建DCS和CURS3表达质粒：pRSF-DCS-CURS3、pET-DCS-CURS3、pCDF-DCS-CURS3和pACYC-DCS-CURS3；
(4)通过酶切酶连方法构建AccBC和DtsR1表达质粒：pRSF-AccBC-DtsR1、pET-AccBC-DtsR1、pCDF-AccBC-DtsR1和pACYC-AccBC-DtsR1；
(5)分别取步骤(2)、(3)、(4)中的表达质粒，按不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：康前进，胡晓婧，欧一新，白林泉，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31