一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器的构建及应用。本发明专利技术公开的镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器含有CadR基因、lpp‑ompA‑CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动这三种基因表达的启动子，启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；CadR基因编码氨基酸序列是序列表中序列2的CadR蛋白质lpp‑ompA‑CdBD基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的lpp‑ompA‑CdBD蛋白质。实验证明，本发明专利技术的镉离子微生物全细胞生物传感‑吸附器可以指示镉离子的存在，并可同时实现对镉离子的吸附，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用
本专利技术涉及生物
中，一种镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器的构建及应用。
技术介绍
自然界中镉的原始分布并不广泛，多以硫化镉的形态存在于非铁金属矿和岩层中。镉元素主要通过地壳活动、化学风化等方式进行自然播散。镉是人体非必需元素并可对人体健康造成严重危害，镉是具有致癌、致畸、致突变作用的剧毒重金属元素。伴随人类活动如采矿、冶炼，特别是工农业的迅猛发展，镉广泛应用于电镀、镍-镉充电电池、半导体元件、合金、塑料稳定剂、杀虫剂、防腐剂等制造行业。工业化进程伴随着镉元素的“重新分布”，镉元素目前普遍存在于大气、土壤、水体中。值得注意的是，镉作为不可自然降解的重金属，其毒性具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，环境中低浓度的镉可通过土壤-植物、水体-浮游生物-鱼贝类迁移转化，经食物链积累和放大，进而对人类产生更大的毒害。消除环境镉残留却是耗时耗资的大工程。环境中含镉污染物的检测、吸附和回收是化学工作者关注的焦点。目前环境重金属残留的检测方法主要为物理化学方法，如原子光谱法、电感耦合等离子体质谱法。这类方法需要昂贵的专业设备，根据样品性质需要摸索不同的前处理方法，检测时效性差，并对操作人员的专业技术要求高。20世纪70年代以来，微生物传感器的开发为环境中重金属的检测提供更多选择和诸多便利，微生物传感器重点检测可生物利用的重金属毒物，检测快速，成本低廉，但灵敏度不高是其主要缺点。围绕运用生物学手段处理环境重金属污染，避免物理化学方法可能对环境造成的二次污染，研究者们结合基因工程、蛋白质工程和微生物细胞表面展示技术，尝试将一些可吸附有毒重金属的靶分子展示在模式微生物大肠杆菌、酵母等细胞表面，开发出了一系列微生物金属吸附器。然而由于微生物展示系统的局限性，研究主要集中在金属结合寡肽、金属硫蛋白的菌体细胞表面展示。目前，已有多个镉离子微生物全细胞生物传感器成功开发，用于镉离子的高特异性生物指示。镉离子微生物全细胞吸附器也有研究报道，可实现镉离子的高选择性吸附，但关于一体化的镉离子微生物全细胞生物传感-吸附器，尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何同时实现环境中镉的指示与富集。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种具有镉生物传感-吸附器功能的微生物，记为微生物1，该微生物含有CadR基因、lpp-ompA-CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因与所述荧光蛋白编码基因表达的启动子，所述启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；所述CadR基因编码如下A1)、A2)或A3)的CadR蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；所述lpp-ompA-CdBD基因编码如下B1)、B2)或B3)的lpp-ompA-CdBD蛋白质：B1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；B2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。所述微生物表达CadR蛋白质、lpp-ompA-CdBD蛋白质与所述荧光蛋白。所述蛋白质标签可如下表所示。表：标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。上述B2)中的蛋白质，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述CadR基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。上述lpp-ompA-CdBD基因可通过将序列1的第577-1266位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1的第577-1266位所示的DNA分子编码序列4所示的蛋白质。上述微生物1中，所述CadR基因可为如下a1)或a2)或a3)：a1)序列表中序列3所示的DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子。a3)所述DNA分子可为序列1的第7-450位。所述lpp-ompA-CdBD基因可为如下b1)或b2)或b3)：b1)序列表中序列1的第577-1266位所示的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子。所述微生物1存在由非所述复合物激活的CadR蛋白质的本底表达。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码CadR蛋白质或lpp-ompA-CdBD蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术的CadR蛋白质或lpp-ompA-CdBD蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CadR蛋白质且具有CadR蛋白质功能、编码lpp-ompA-CdBD蛋白质且具有lpp-ompA-CdBD蛋白质功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微生物，含有CadR基因、lpp-ompA-CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因与所述荧光蛋白编码基因表达的启动子，所述启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；/n所述CadR基因编码如下A1)、A2)或A3)的CadR蛋白质：/nA1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；/nA2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；/nA3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；/n所述lpp-ompA-CdBD基因编码如下B1)、B2)或B3)的lpp-ompA-CdBD蛋白质：/nB1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；/nB2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；/nB3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.微生物，含有CadR基因、lpp-ompA-CdBD基因、荧光蛋白编码基因与驱动所述CadR基因、所述lpp-ompA-CdBD基因与所述荧光蛋白编码基因表达的启动子，所述启动子的活性由CadR蛋白质与镉的复合物激活；
所述CadR基因编码如下A1)、A2)或A3)的CadR蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述lpp-ompA-CdBD基因编码如下B1)、B2)或B3)的lpp-ompA-CdBD蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；
B2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。


2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于：所述CadR基因为如下a1)或a2)或a3)：
a1)序列表中序列3所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述CadR蛋白质的DNA分子；
和/或，所述lpp-ompA-CdBD基因为如下b1)或b2)或b3)：
b1)序列表中序列1的第577-1266位所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述lpp-ompA-CdBD蛋白质的DNA分子。


3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭妍，张乃兴，惠长野，郑红菊，陈闽鹏，李丽梅，陈钰婷，刘征宇，
申请(专利权)人：深圳市职业病防治院，
类型：发明
国别省市：广东;44