抗PSMA蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，提供了一种抗PSMA蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达。发明专利技术人还提供了一株分泌抗PSMA蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系11D1E5E10，保藏号为：CGMCC NO.19683。抗PSMA蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PSMA蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

【技术实现步骤摘要】
抗PSMA蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及抗PSMA蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
技术介绍
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，世界范围内男性癌症相关死亡率第三位。据统计，目前约有1-2％的男性死于前列腺癌。近年来,随着社会的高速发展，人们生活质量得到提高,人口平均寿命延长及诊疗技术也在日益进步,但前列腺癌发病率仍然呈逐渐上升的趋势，目前前列腺癌的发病率约为11.2％。前列腺癌的早期诊断,也日益受到学者的重视。前列腺特异性膜抗原(PSMA)在前列腺癌细胞的表面上以及在多种实体瘤的新脉管系统中独特地过度表达。因此，PSMA作为用于前列腺癌的检测和治疗的临床生物标记已引起了注意。前列腺特异膜抗原，简称PSMA，首次发现于1987年。它是一个Ⅱ型跨膜糖蛋白，它由750个氨基酸构成包含19个氨基酸的胞内区、24个氨基酸的跨膜区和707个氨基酸的胞外区，蛋白质的分子量为84KDa,经糖基化作用后，分子量约100KDa。PSMA的基因定位于11号染色体的断臂上，全长60Kb,包括19个外显子和18个内含子。PMSA高表达于前列腺癌上皮细胞膜，其表达量与肿瘤细胞的数量及侵袭性呈正相关。PSMA主要表达与前列腺上皮细胞膜上，在前列腺癌有非常高比例的表达，在恶性度较高的、转移性的及激素难治性的前列腺癌其表达进一步增高。因此，PSMA具有较高的前列腺特异性，与恶性肿瘤疾病进程密切相关，是较理想的肿瘤标记物和前列腺癌生物治疗靶点。免疫组化显示，PSMA在前列腺的正常组织，良性增生组织，上皮内增生，癌组织中均有表达，且表达强度依次上升，在前列腺癌中表达强度最高；在前列腺癌淋巴结转移灶，骨转移灶中表达呈阳性。同时PSMA在多种非前列腺的恶性肿瘤也有一定的表达，这些肿瘤主要包括肾透明细胞癌，膀胱移行细胞癌，结肠腺癌，胰导管癌，非小细胞肺癌，如组织肉瘤，乳腺癌等。PSMA具有较高的特异性和位于前列腺上皮细胞膜的特性，其在前列腺癌及其转移灶中表达增高，在前列腺癌的靶向治疗中具有重要意义。
技术实现思路
专利技术人提供了一种抗PSMA蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别PSMA蛋白。进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.19683的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系11D1E5E10，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2020年04月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步地，所述抗PSMA蛋白为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。进一步地，所述抗PSMA蛋白单克隆抗体以重组蛋白为免疫原进行制备所述重组蛋白包含具有抗原性的PSMA片段以及组氨酸蛋白标签，所述PSMA片段为人PSMA蛋白的第307位至第750位氨基酸片段。专利技术人还提供了一株分泌抗PSMA蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系11D1E5E10，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：中国北京，保藏日期为2020年4月24日，保藏号为：CGMCCNO.19683。专利技术人还提供上述任一所述的抗PSMA蛋白单克隆抗体，在PSMA蛋白免疫检测中的用途。进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。区别于现有技术，上述技术方案选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的PSMA第307位至第750位氨基酸区域用于重组表达。6个His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗PSMA蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系11D1E5E10,以及由该细胞系所分泌的抗PSMA蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达PSMA蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测,可降低误读，提高诊断的准确性。附图说明图1：纯化后PSMA单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2：前列腺癌免疫组化染色结果图；左为(11D1E5E10)的PSMA，右为市售PSMA(1D6)。具体实施方式实施例1重组PSMA蛋白片段的制备一、基因克隆从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号Q04609的PSMA蛋白序列作为标准序列。依据其与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定PSMA氨基酸序列第307位至第750位序列，其对应的核苷酸序列为SEQIDNo.1。将目的蛋白片段连接于质粒载体petβ2M上(petβ2M载体采购自武汉金开瑞生物工程有限公司，内含β2M蛋白序列及His标签)合成以上PSMA重组蛋白质粒。转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。β2M为I类主要组织相容性复合物(MHC)的组分，参与抗原肽向免疫系统的呈递，促进抗体的生成。6-His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。二、重组蛋白表达纯化将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta中，挑取平板上的克隆接种扩培，保菌。接菌液至4mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，270rpm条件下振荡培养过夜。然后转接至200mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、270rpm条件下振荡培养8H后,收集菌体。将表达重组蛋白的菌体进行超声波破碎处理。将菌液8000g离心10min，去上清培养基，保留菌体用适量的PBS缓冲液重悬洗涤，菌体中加入镍柱平衡缓冲液进行超声破碎。超声破碎至菌液澄清后，离心，分别收集沉淀及上清。将破碎上清、沉淀以及经诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的存在位置。采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。纯化主要步骤参照常州天地人和生物科技有限公司说明书进行。纯化后的目的蛋白进行透析除盐，并用超滤管进行浓缩。最后通过紫外微量分光光度计测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，通过ELISA检测分析、确定其特异性。表1为PSMA抗原特异性检测结果。图1：纯化后PSMA单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。表1：ELISA检测PSMA抗原特异性注：over表示超过仪器的测量范围，即反应很强。实施例211D1E5E10杂交瘤细胞系的建立...

【技术保护点】
1.一种抗PSMA蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗PSMA蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核苷酸序列所编码。


3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别PSMA蛋白。


4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别PSMA蛋白中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.19683的杂交瘤细胞系产生。


6.根据权利要求1所述的单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲玲，陈惠玲，王小亚，吴茂，邓晓，李恢波，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35