猪伪狂犬病毒gB&gD抗体检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一方面公开了一种猪伪狂犬病毒gB&gD抗体检测试剂盒，所述试剂盒能同时检测猪伪狂犬病毒gB抗原抗体和gD抗原抗体，所述的试剂盒中的抗原包被板为同时包被有PRV

【技术实现步骤摘要】
猪伪狂犬病毒gB＆gD抗体检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gB&gD抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。
[0003]伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～ 180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA分子，大小约150kb，平均G+C含量高达74％，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段、独特短区段及位于US两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)组成。目前已发现11种PRV糖蛋白，其中，gB、gC、gD均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力，因此，gB、 gC、gD是研制PRV亚单位疫苗以及评价疫苗免疫效果的首选糖蛋白，其中尤以gB和gD为最好。
[0004]但是，目前市面流行的用于评价PRV免疫效果的试剂盒都只能检测gB蛋白产生的抗体，不能评价gD蛋白产生的抗体，因此对PRV疫苗免疫后的实际情况的评价可能存在一定的假阴性的检测。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种能同时评价PRV
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gB蛋白和 PRV
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gD蛋白的抗体的试剂盒，以弥补现有试剂盒技术的不足。本专利技术的目的之二是提供了一种制备该试剂盒的方法。
[0006]因此，本专利技术一方面提供了一种猪伪狂犬病毒gB&gD抗体检测试剂盒，所述试剂盒能同时检测猪伪狂犬病毒gB抗原抗体和gD抗原抗体，其特征在于，所述的试剂盒中的抗原包被板为同时包被有PRV
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gB蛋白和PRV
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gD蛋白的酶标板。
[0007]优选地，本专利技术所述的抗原包被板上PRV
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gB蛋白和PRV
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gD蛋白的包被浓度均为100ng/ 孔/100μL。
[0008]优选地，本专利技术所述的试剂盒还包括：样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、质控品1、质控品2和质控品3；其中，所述的样品稀释液为含有2％BSA的1
×
PBST溶液；所述的浓缩洗涤液为25
×
PBST溶液，在使用前稀释到1
×
PBST 溶液；所述的酶标抗体为羊抗猪IgG酶标抗体；所述的显色液为TMB单组分溶液；所述的终止液为2M的H2SO4溶液；所述的阳性对照为PRV抗体OD450nm值在0.9～1.5之间的阳性血清；所述的阴性对照为PRV抗体OD450nm值小于0.2的阴性血清；所述的质控品1为 S/P值在1.5～
2.0之间的强阳性血清；所述的质控品2为S/P值在0.5～1.0之间的弱阳性血清；所述的质控品3为S/P值小于0.35的阴性血清。
[0009]优选地，本专利技术所述的阳性对照为PRV抗体OD450nm值在1.0～1.2之间的阳性血清。
[0010]优选地，本专利技术所述的阴性对照为PRV抗体OD450nm小于0.1的阴性血清。
[0011]优选地，本专利技术所述的阳性对照孔每孔OD450nm读数大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数<0.3，空白对照OD450nm读数＜0.1，质控品1的S/P值在1.5～ 2.0之间，质控品2的S/P值在0.5～1.0之间，质控品3的S/P值＜0.35时，试验成立，结果有效。
[0012]再一方面，本专利技术还提供了一种使用所述的试剂盒对待检样品进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；(2)加样本：根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100μL/孔，同时设阳性对照、阴性对照各2孔，质控品1、质控品2、质控品3、空白对照各1孔；(3)孵育：置37℃温箱孵育30分钟；(4)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；(5)二抗孵育：对应孔中加入羊抗猪IgG酶标抗体， 100μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟；(6)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；(7)显色：加入显色液，100μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟；(8)终止：加入终止液，50μL/孔，轻微震荡混合均匀；(9) 读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取OD450nm值； (10)S/P值计算：按照以下计算公式，计算S/P值：
[0013](11)试验有效性断判：阳性对照孔每孔 OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3，空白对照OD450nm读数＜0.1，质控品1的S/P值在1.5～2.0之间，质控品2的S/P值在0.5～ 1.0之间，质控品3的S/P值＜0.35；(12)结果判定：当S/P值大于0.399时判为阳性；当S/P 值小于等于0.399时判为阴性；
[0014]再一方面，本专利技术还提供了一种制备所述试剂盒的方法，其特征在于，所述的方法包括抗原包被板的制备、样品稀释液的配制与分装、浓缩洗涤液的配制与分装、酶标抗体的配制与分装、阳性对照的制备、阴性对照的制备、质控品1的制备、质控品2的制备、质控品3 的制备、显色液的分装、终止液的配制与分装。
[0015]优选地，本专利技术所述的抗原包被板的制备包括以下步骤：1)包被：使用包被缓冲液将纯化的PRV
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gB重组蛋白和PRV
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gD重组蛋白分别稀释到2μg/mL，再将稀释好的PRV
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gB重组蛋白和PRV
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gD重组蛋白等体积混合，混匀后加入酶标板，100μL/孔，在2～8℃下作用12～ 15小时；2)洗涤：用1
×
PBST洗涤3次，每次30秒，每孔300μL，最后一次拍干；3)封闭：加含1％BSA的PBS，200μL/孔，37℃封闭2小时；4)洗涤：用1
×
PBST洗涤3次，每孔300μL，每次30秒，拍干，加干燥剂并抽真空保存。
[0016]再一方面，本专利技术还提供了一种所述的试剂盒在猪伪狂犬病毒疫苗免疫效果评价中的应用。
[0017]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒gB&gD抗体检测试剂盒，所述试剂盒能同时检测猪伪狂犬病毒gB抗原抗体和gD抗原抗体，其特征在于，所述的试剂盒中的抗原包被板为同时包被有PRV
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gB蛋白和PRV
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gD蛋白的酶标板。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原包被板上PRV
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gB蛋白和PRV
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gD蛋白的包被浓度均为100ng/孔/100μL。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、质控品1、质控品2和质控品3；其中，所述的样品稀释液为含有2％BSA的1
×
PBST溶液；所述的浓缩洗涤液为25
×
PBST溶液，在使用前稀释到1
×
PBST溶液；所述的酶标抗体为羊抗猪IgG酶标抗体；所述的显色液为TMB单组分溶液；所述的终止液为2M的H2SO4溶液；所述的阳性对照为PRV抗体OD450nm值在0.9～1.5之间的阳性血清；所述的阴性对照为PRV抗体OD450nm值小于0.2的阴性血清；所述的质控品1为S/P值在1.5～2.0之间的强阳性血清；所述的质控品2为S/P值在0.5～1.0之间的弱阳性血清；所述的质控品3为S/P值小于0.35的阴性血清。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为PRV抗体OD450nm值在1.0～1.2之间的阳性血清。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为PRV抗体OD450nm小于0.1的阴性血清。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照孔每孔OD450nm读数大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数<0.3，空白对照OD450nm读数＜0.1，质控品1的S/P值在1.5～2.0之间，质控品2的S/P值在0.5～1.0之间，质控品3的S/P值＜0.35时，试验成立，结果有效。7.一种使用权利要求1至6任一权利要求所述的试剂盒对待检样品进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；2)加样本：根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100μL/孔，同时设阳性对照、阴性对照各2孔，质控品1、质控品2...

【专利技术属性】
技术研发人员：查银河，周泉丽，舒建洪，陶思锐，童夏霞，陈勇锋，盛敏成，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：