基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法技术

本发明专利技术公开基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，登革病毒纳米磁珠

【技术实现步骤摘要】
基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法


[0001]本专利技术涉及纳米磁珠免疫层析
具体地说是基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法。

技术介绍

[0002]登革热(Dengue Fever)是由黄病毒属的登革病毒(Dengue Vi rus，DENV)引起的急性传染病。登革病毒通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播引起登革热，在全世界热带和亚热带地区普遍存在，轻症表现为持续发热、头痛、关节疼痛、肌肉痛等，重症为死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。由于全球变暖和城市盲目扩张等因素，在过去的50年中，这种传播速度相当快的病毒性疾病，在全球发病率增长了30倍。据统计，全球每年在100多个流行国家中有3.9亿人感染登革病毒，并且进一步蔓延到以前未受影响的国家和地区。同时，每年出现数10万重症病例，包括2万人死亡。在我国广东、广西、云南、海南、江西等地也曾多次暴发登革疫情，造成严重的公共卫生问题，引起广大研究人员的高度重视。
[0003]有效的登革疫苗需要同时对所有血清型登革病毒具备均衡且持久的抗性，制备登革疫苗的平衡免疫应答并且保证持久力非常困难，目前尚无有效成熟的登革疫苗。我国每年流行的登革热基本均为输入性病例，如果不采取有效的检测及防控措施，输入病例通过本地蚊媒介导传播，能造成快速的本地疫情爆发。因此，对登革热的早期诊断尤其重要。登革热防控的黄金窗口期一般为两周左右，发展高灵敏的登革病毒检测方法，在窗口期内对病毒感染者做出快速识别、诊断，对患者及时采取相应的治疗措施，启动传染源隔离、消杀灭蚊等措施，避免形成大规模的爆发和流行。
[0004]由于登革检测与其他黄病毒存在交叉反应，所以在目前来说还没有血清学检测方法的金标准。目前实验室常用的登革热检测技术有病毒分离、实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联吸附试验(ELISA)、胶体金法等。其中病毒分离操作繁琐，敏感度低，不适于早期诊断；RT-PCR方法需要专业的仪器设备，过程复杂，成本高，不利于大规模检测；ELISA方法操作复杂，灵敏度和特异性都低于RT-PCR方法；胶体金法灵敏度和特异性比ELISA方法还略低，成本又高于ELISA。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度、操作简单、可用于大规模快速诊断的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，包括如下步骤：
[0008](1)登革病毒纳米磁珠-抗体探针的制备；
[0009](2)纳米磁珠试纸条的组装；
[0010](3)使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测。
[0011]上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(1)中，纳
米磁珠为市购纳米磁珠，粒径为50nm。
[0012]上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(1)中：
[0013](1-1)制备活化的纳米磁珠：纳米磁珠用去离子水洗涤三次，离心后弃上清，用pH为6的MES缓冲溶液重悬，同时加入活化剂，摇床摇匀，进行活化反应，然后使用MES缓冲溶液洗涤1次，最后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米磁珠溶液，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物；
[0014](1-2)登革病毒鼠单克隆标记抗体与活化的纳米磁珠溶液4℃过夜孵育，之后用pH为7.2的Tris缓冲液室温孵育30分钟以终止反应，采用纳米磁珠分离装置磁分离后重悬于0.5mL BSA-Tris缓冲液中，得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。
[0015]上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述纳米磁珠分离装置包括主体机构、供料机构、清洗机构、震动机构、抽气机构和磁体机构；
[0016]所述供料机构与主体机构流体连通，所述清洗机构与主体机构流体连通，且所述供料机构与清洗机构均位于主体机构的顶部，所述震动机构固定安装在主体机构的外表面，所述抽气机构设置在主体机构的底部，所述磁体机构滑动安装在主体机构的上表面。
[0017]上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述主体机构包括安装板、第一通孔、钢化玻璃管、进料软管、第一阀门、供料软管和第二阀门；
[0018]所述安装板内部垂直贯穿开设有第一通孔，所述第一通孔的直径大于钢化玻璃管的直径，所述第一通孔的数量不仅可以有三个，还可以根据实际再对其进行增加；所述钢化玻璃管贯穿第一通孔，所述钢化玻璃管采用强度高、抗拉性强、抗冲击性强的钢化玻璃制成，且所述钢化玻璃管的数量根据第一通孔的数量或实际需要决定；
[0019]所述钢化玻璃管的顶端与进料软管固定连接，且钢化玻璃管的顶端设置有第一阀门，所述第一阀门由控制器控制，所述第一阀门与进料软管相连接，所述进料软管采用生物化学惰性材料制成；所述多个进料软管的顶端均与同一根供料软管相连接，所述供料软管与进料软管所用材质相同；
[0020]所述钢化玻璃管上设置有第二阀门，所述第二阀门位于安装板的底部；其中所述安装板平行于地面放置，所述钢化玻璃管垂直与安装板或倾斜与安装板设置；
[0021]所述供料机构包括混合箱、抽液管、第一微泵和第三阀门；
[0022]所述混合箱内放置有样品液与纳米磁珠的混合液，所述抽液管的一端放置于混合箱内的底部位置，且所述抽液管的另一端与供料软管相连接，所述抽液管与供料软管的材质相同；
[0023]所述抽液管靠近供料软管的地方设置有第一微泵，所述第一微泵采用精密注射泵；所述抽液管与供料软管相连接的地方设置有第三阀门，所述第一微泵与第三阀门均由控制器控制。
[0024]上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述清洗机构包括洗涤箱、第一连接管、第四阀门、洗脱箱、第二连接管、第五阀门、第二微泵、第六阀门、水箱、第三连接管、第七阀门和高压泵；
[0025]所述洗涤箱内装有洗涤液，所述洗涤箱通过第一连接管与第二微泵相连接，所述第一连接管上设置有第四阀门，且所述第一连接管与供料软管的材质相同；所述洗脱箱内装有洗脱液，所述洗脱箱通过第二连接管与第二微泵相连接，所述第二连接管上设置有第
五阀门，且所述第二连接管与供料软管材质相同；所述第四阀门和第五阀门均由控制器控制；
[0026]所述第二微泵有两个进液口，且两个进液口互不相通，所述两个进液口分别于第一连接管和第二连接管相连接，所述第二微泵与第一微泵一样采用精密注射泵，所述第二微泵的出液口与供料软管相连通，且供料软管靠近第二微泵的位置设置有第六阀门，且所述第六阀门有多个，分别设置于供料软管上位于每两个进料软管之间；所述第二微泵与第六阀门均由控制器控制；
[0027]所述水箱通过第三连接管与供料软管相连接，且第三连接管与供料软管相连接的地方位于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)登革病毒纳米磁珠-抗体探针的制备；(2)纳米磁珠试纸条的组装；(3)使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测。2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，纳米磁珠为市购纳米磁珠，粒径为50nm。3.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(1)中：(1-1)制备活化的纳米磁珠：纳米磁珠用去离子水洗涤三次，离心后弃上清，用pH为6的MES缓冲溶液重悬，同时加入活化剂，摇床摇匀，进行活化反应，然后使用MES缓冲溶液洗涤1次，最后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米磁珠溶液，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物；(1-2)登革病毒鼠单克隆标记抗体与活化的纳米磁珠溶液4℃过夜孵育，之后用pH为7.2的Tris缓冲液室温孵育30分钟以终止反应，采用纳米磁珠分离装置磁分离后重悬于0.5mL BSA-Tris缓冲液中，得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。4.根据权利要求3所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述纳米磁珠分离装置包括主体机构(100)、供料机构(200)、清洗机构(300)、震动机构(400)、抽气机构(500)和磁体机构(600)；所述供料机构(200)与主体机构(100)流体连通，所述清洗机构(300)与主体机构(100)流体连通，且所述供料机构(200)与清洗机构(300)均位于主体机构(100)的顶部，所述震动机构(400)固定安装在主体机构(100)的外表面，所述抽气机构(500)设置在主体机构(100)的底部，所述磁体机构(600)滑动安装在主体机构(100)的上表面。5.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述主体机构(100)包括安装板(101)、第一通孔(102)、钢化玻璃管(103)、进料软管(104)、第一阀门(105)、供料软管(106)和第二阀门(107)；所述安装板(101)内部垂直贯穿开设有第一通孔(102)，所述第一通孔(102)的直径大于钢化玻璃管(103)的直径，所述第一通孔(102)的数量不仅可以有三个，还可以根据实际再对其进行增加；所述钢化玻璃管(103)贯穿第一通孔(102)，所述钢化玻璃管(103)采用强度高、抗拉性强、抗冲击性强的钢化玻璃制成，且所述钢化玻璃管(103)的数量根据第一通孔(102)的数量或实际需要决定；所述钢化玻璃管(103)的顶端与进料软管(104)固定连接，且钢化玻璃管(103)的顶端设置有第一阀门(105)，所述第一阀门(105)由控制器控制，所述第一阀门(105)与进料软管(104)相连接，所述进料软管(104)采用生物化学惰性材料制成；所述多个进料软管(104)的顶端均与同一根供料软管(106)相连接，所述供料软管(106)与进料软管(104)所用材质相同；所述钢化玻璃管(103)上设置有第二阀门(107)，所述第二阀门(107)位于安装板(101)的底部；其中所述安装板(101)平行于地面放置，所述钢化玻璃管(103)垂直与安装板(101)或倾斜与安装板(101)设置；
所述供料机构(200)包括混合箱(201)、抽液管(202)、第一微泵(203)和第三阀门(204)；所述混合箱(201)内放置有样品液与纳米磁珠的混合液，所述抽液管(202)的一端放置于混合箱(201)内的底部位置，且所述抽液管(202)的另一端与供料软管(106)相连接，所述抽液管(202)与供料软管(106)的材质相同；所述抽液管(202)靠近供料软管(106)的地方设置有第一微泵(203)，所述第一微泵(203)采用精密注射泵；所述抽液管(202)与供料软管(106)相连接的地方设置有第三阀门(204)，所述第一微泵(203)与第三阀门(204)均由控制器控制。6.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述清洗机构(300)包括洗涤箱(301)、第一连接管(302)、第四阀门(303)、洗脱箱(304)、第二连接管(305)、第五阀门(306)、第二微泵(307)、第六阀门(308)、水箱(309)、第三连接管(310)、第七阀门(311)和高压泵(312)；所述洗涤箱(301)内装有洗涤液，所述洗涤箱(301)通过第一连接管(302)与第二微泵(307)相连接，所述第一连接管(302)上设置有第四阀门(303)，且所述第一连接管(302)与供料软管(106)的材质相同；所述洗脱箱(304)内装有洗脱液，所述洗脱箱(304)通过第二连接管(305)与第二微泵(307)相连接，所述第二连接管(305)上设置有第五阀门(306)，且所述第二连接管(305)与供料软管(106)材质相同；所述第四阀门(303)和第五阀门(306)均由控制器控制；所述第二微泵(307)有两个进液口，且两个进液口互不相通，所述两个进液口分别于第一连接管(302)和第二连接管(305)相连接，所述第二微泵(307)与第一微泵(203)一样采用精密注射泵，所述第二微泵(307)的出液口与供料软管(106)相连通，且供料软管(106)靠近第二微泵(307)的位置设置有第六阀门(308)，且所述第六阀门(308)有多个，分别设置于供料软管(106)上位于每两个进料软管(104)之间；所述第二微泵(307)与第六阀门(308)均由控制器控制；所述水箱(309)通过第三连接管(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘键，刘昕，张永江，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：