用于产生甲基丙烯酸酯的方法技术

本发明专利技术涉及用于使用甲基丙烯酸酯耐受性微生物产生甲基丙烯酸酯的方法。微生物产生甲基丙烯酸酯的方法。微生物产生甲基丙烯酸酯的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生甲基丙烯酸酯的方法
[0001]引言
[0002]甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate，MMA)是化学工业中的重要单体。MMA的主要用途是生产多种应用的塑料；然而，MMA也可以用于在骨科手术中使用的骨水泥(bone cement)。最重要的聚合应用是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的铸造、模塑或挤出(extrusion)，以生产高光学透明度塑料。PMMA的全球消耗估计为每年约210万吨。
[0003]虽然最广泛使用的甲基丙烯酸酯是MMA，但是也可以使用甲基丙烯酸或MMA分别通过直接酯化或通过酯交换产生其他甲基丙烯酸酯。实例是2-甲基丙-2-烯酸丁酯(BMA，具有化学式C8H
14
O2的甲基丙烯酸酯)、甲基丙烯酸异丁酯(iBMA)、甲基丙烯酸乙酯(EMA)和甲基丙烯酸2-乙基己酯(2EHMA)。BMA由MMA与丁醇进行酯交换产生。所有这些酯和PMMA都具有许多的应用，即在制造纺织品、涂料和粘合剂、包装、润滑剂、汽车设备、LCD屏幕、医疗设备和家用物品中的应用。
[0004]MMA目前仅通过化学手段产生，并且目前用于产生MMA的方法包括丙酮氰醇(ACH)途径和从多种C
2-C4前体开始的其他途径。用于产生MMA的最成功的方法之一是
‘
Alpha方法
’
，其中MMA通过丙酸甲酯这种酯与甲醛的无水反应获得。在Alpha方法中，丙酸甲酯通过乙烯的羰基化产生。这种乙烯原料来源于化石燃料。与MMA产生中常用的其他方法相比，Alpha方法提供了许多优势。这些优势包括危险化学物质使用减少、高得多的产物选择性以及降低的对原油来源的原料的依赖。然而，原料的定价与汽油的成本相关。因此，开发克服这些缺陷的用于产生MMA的替代方法将是期望的。
[0005]可以使用微生物经由发酵而不是通过化学合成产生高价值的化学品。重组DNA技术和这样的微生物的合成代谢工程已经允许朝着产生特定化学品来重建代谢途径。最近正在开发朝着丙烯酸酯的生物产生的若干可持续途径。这些方法通常集中于经由微生物发酵从可再生原料产生丙烯酸酯。例如，WO2016/185211描述了用于使用重组微生物产生甲基丙烯酸和/或其衍生物的方法。
[0006]然而，在一定浓度，丙烯酸酯诸如MMA和BMA在发酵期间的积累通常对生物催化剂是有毒性的，抑制细胞生长和/或导致细胞死亡。特别地，甲基丙烯酸高级烷基酯(诸如甲基丙烯酸丁酯(BMA))比甲基丙烯酸低级烷基酯(诸如MMA)有更多毒性。因此，这可能是使用微生物(特别是工业大规模)生物产生甲基丙烯酸烷基酯的限制因素。
[0007]已知，细菌能够适应环境刺激，特别地通过适应控制基因表达的调节网络适应环境刺激。存在若干种这样的网络，包括氧化应激响应和多药耐药系统。
[0008]鉴于甲基丙烯酸烷基酯对微生物的毒性作用，以及鉴于与目前用于产生MMA的化学方法相关的缺点，提供具有改进的对甲基丙烯酸酯的耐受性的微生物用于在产生甲基丙烯酸烷基酯的方法中使用将是有利的。
[0009]因此，本专利技术的目的是消除或减轻这些问题中的一个或更多个，提供用于产生甲基丙烯酸酯，特别地BMA和/或MMA的改进方法，并且提供具有改进的对甲基丙烯酸酯的耐受性的微生物。
[0010]概述
25113在具有0％(
□
)、0.01％(
◇
)、0.05％(Δ)和0.1％(x)v/v的BMA时在M9基本培养基中在37℃和200RPM生长。b)高浓度的BMA的影响。使用具有50mL培养基的250mL锥形瓶使大肠杆菌BW25113在具有0％(
□
)、0.5％(
◇
)、1.0％(Δ)、5.0％(
○
)、10.0％(x)和20.0％(+)v/v的BMA时在M9基本培养基中生长。c)大肠杆菌对BMA的固有耐受性的测试。使用具有50mL培养基的250mL锥形瓶使大肠杆菌BW 25113在具有0％(
□
)、0.1％(x)、0.5％(*)、传代培养后0.1％(
◇
)、传代培养后0.5％(Δ)v/v的BMA时在M9基本培养基中在37℃和200RPM生长(一式三份)。d)ADE-1。随着BMA浓度的顺序增加，连续分批培养中的适应性进化。大肠杆菌在具有10mL培养基的50mL管(在3个平行管中，管1(实线)、管2(点线)和管3(虚线))中在具有10g L-1葡萄糖和BMA的M9基本培养基中在37℃和200RPM生长。使用最佳生长培养物作为3个管中各自的起始培养物，在每次连续转移中以0.1％BMA(x)、0.5％BMA(
□
)、1％BMA(
◇
)、5％(Δ)、10％(
○
)和20％(+)增加BMA浓度。e)ADE-3。连续分批培养中的适应性进化，每个BMA浓度中有5个连续培养。大肠杆菌在具有10mL培养基的50mL管(在3个平行管中，管1(实线)、管2(点线)和管3(虚线))中在具有10g L-1葡萄糖和BMA的M9基本培养基中在37℃和200RPM生长。BMA浓度从0.1％v/v(x)增加至0.5％v/v(
□
)、1％v/v(
◇
)、5％v/v(Δ)、10％v/v(*)和20％v/v(
○
)，使用每个单独的管作为随后转移的起始培养物。f)ADE-3。连续分批培养中的适应性进化，1个连续培养在0.1％v/v BMA，2个连续转移在10％v/v BMA，并且45个连续转移在20％v/v BMA。大肠杆菌在具有10mL培养基的50mL管(在3个平行管中，管1(实线)、管2(点线)和管3(虚线))中在具有10g L-1葡萄糖和BMA的M9基本培养基中在37℃和200RPM生长。BMA浓度从0.1％v/v(x)增加至10％v/v(
□
)和20％v/v(
◇
)，使用最佳生长培养物作为3个管中各自的起始培养物。g)ADE-4，恒化器中BMA耐受大肠杆菌的适应性进化和选择。微型生物反应器(55mL工作体积)中的大肠杆菌的恒化器培养物在具有1g L-1葡萄糖的M9基本培养基中在37℃和～0.3L h-1的通气速率生长，其中BMA浓度(
◆
)从0逐渐增加至20％v/v，并且稀释速率(υ)从0变化至0.55h-1。细胞浓度(
●
)以细胞干重g L-1报告。h)使用具有50mL培养基的250mL锥形瓶使来自ADE-1和ADE-2的分离株在具有20％v/v BMA的M9基本培养基中在37℃和200RPM生长(一式三份)。分离株2(Δ)、3(
◇
)、5(*)、6(-)、7(
○
)和没有BMA的野生型(
─
点线)。i)使用具有50mL培养基的250mL锥形瓶使来自ADE-3的分离株在具有20％v/v BMA的M9基本培养基中在37℃和200RPM生长(一式三份)。分离株14(
□...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生甲基丙烯酸酯的方法，所述方法包括：a)在发酵培养基中提供与野生型微生物相比具有增加的对甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的耐受性的遗传修饰的微生物，和b)使所述微生物在产生甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的条件下生长。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物当在约37℃在液体培养基中生长时耐受至少20％v/v的甲基丙烯酸C
3-C
12
酯。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物是细菌。4.根据前述权利要求所述的方法，其中所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。5.根据前述权利要求所述的方法，其中所述细菌选自以下属：埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、甲烷球菌属(Methanococcus)、醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮根瘤菌属(Axorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、无形体属(Anaplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴尔通体属(Bartonella)、鲍特菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、荚膜杆菌属(Calymmatobacterium)、弯曲菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭菌属(Clostridium)、柯克斯体属(Coxiella)、贪铜菌属(Cupriavidus)、埃立克体属(Ehrlichia)、肠球菌属(Enterococcus)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、分支杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟菌属(Neisseria)、巴斯德菌属(Pasteurella)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次氏体属(Rickettsia)、罗沙利马体属(Rochalimaea)、罗氏菌属(Rothia)、志贺菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、耶尔森菌属(Yersinia)。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。7.根据前述权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的微生物在编码调节氧化应激响应和细菌多药耐药系统或形成氧化应激响应和细菌多药耐药系统的一部分的蛋白的一种或更多种核酸中包含突变。8.根据前述权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的微生物在一种或更多种以下核酸序列中包含突变：soxR核酸序列、acrR核酸序列、rob核酸序列和/或marR核酸序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述soxR核酸序列包含SEQ ID NO.1或其同源物，所述acrR核酸序列包含SEQ ID NO.2或其同源物，所述rob核酸序列包含SEQ ID NO.5或其
同源物，并且所述marR核酸序列包含SEQ ID NO.7或其同源物。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中突变体soxR核酸序列编码在DNA结合结构域或FE-S簇结构域中具有突变的突变体SoxR蛋白。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变选自以下之一：根据SEQ ID NO.2中列出的SoxR中R20被另一种氨基酸的取代、R20被另一种氨基酸的取代、残基146的缺失或残基139处的截短。12.根据权利要求权利要求8至11中任一项所述的方法，其中突变体acrR核酸序列编码在DNA结合结构域或配体结合结构域中具有突变的突变体AcrR蛋白。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述突变选自以下之一：根据SEQ ID NO.3中列出的AcrR中V29被另一种氨基酸的取代，T32、A191或位置49处的移码突变。14.根据权利要求8至13所述的方法，其中突变体rob核酸序列编码在N末端DNA结合结构域或C末端结构域中具有突变的突变体Rob蛋白。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述突变选自以下之一：根据SEQ ID NO.5中列出的Rob中A70被另一种氨基酸的取代或R156被另一种氨基酸的取代。16.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中突变体marR核酸序列编码在DNA结合结构域中具有突变的MarR蛋白。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述突变是根据SEQ ID NO.7中列出的MarR中V84被另一种氨基酸的取代。18.根据前述权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的微生物在acrR核酸序列和一个或更多个以下列核酸序列中包含突变：soxR核酸序列、rob核酸序列和/或marR核酸序列。19.根据前述权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的生物体包含一个或更多个另外的突变，例如选自表1a或1b的突变。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或更多个另外的突变处于编码调节氧化应激响应和细菌多药耐药系统或形成氧化应激响应和细菌多药耐药系统的一部分的蛋白的核酸中。21.根据前述权利要求所述的方法，其中所述微生物还包含编码甲基丙烯酸C
3-C
12
酯生物合成途径的酶的载体或构建体。22.根据前述权利要求所述的方法，其中所述微生物还包含增强甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的产生的载体或构建体。23.根据前述权利要求所述的方法，所述方法包括从所述发酵培养基中取出所述甲基丙烯酸C
3-C
12
酯和使所取出的甲基丙烯酸C
3-C
12
酯与甲醇进行酯交换的步骤。24.根据前述权利要求所述的方法，其中所述甲基丙烯酸C
3-C
12
酯是BMA。25.一种用于增加微生物对甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的耐受性的方法，所述方法包括将突变引入编码调节氧化应激响应和细菌多药耐药系统或形成氧化应激响应和细菌多药耐药系统的一部分的蛋白的核酸中。26.一种用于使微生物在甲基丙烯酸C
3-C
12
酯存在下生长或维持的方法，所述方法包括在产生甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的条件下，在发酵培养基中提供与野生型微生物相比具有增加的对甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的耐受性的遗传修饰的微生物。27.一种发酵培养基，所述发酵培养基包含甲基丙烯酸C
3-C
12
酯和与野生型微生物相比
具有增加的对甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的耐受性的遗传修饰的微生物。28.与野生型微生物相比具有增加的对甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的耐受性的遗传修饰的微生物用于产生甲基丙烯酸C
3-C
12
酯的用途。29.根据权利要求28所述的用途，其中所述微生物选自肠杆菌科。30.根据权利要求28或29所述的用途，其中所述细菌选自以下属：埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、摩...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐伊，
申请(专利权)人：三菱化学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：