gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用制造技术

本发明专利技术公开了gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞中的应用，包括三种gRNA靶点组合，具体是针对猪F8和F9基因各设计了一对靶点序列，构建了三种CRISPR/Cas9系统，将三种CRISPR/Cas9系统分别转入猪成纤维细胞，筛选基因突变株，获得A、B、A&B型血友病模型猪细胞系。本发明专利技术通过改造Cas9表达载体，显著提高了基因编辑的效率。通过调整gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比，也显著提高编辑效率。本发明专利技术运用体细胞核移植克隆技术可得到A、B、A&B型血友病疾病模型猪，用于进行药物筛选、药效评价、药理毒理、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类血友病提供有力的实验手段。段。

【技术实现步骤摘要】
gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及gRNA靶点组合在构建A、B和A&B型血友病模型猪细胞系中的应用。

技术介绍

[0002]血友病(heamophilia)通常是指一组由基因突变造成凝血因子缺乏的、X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病，目前尚无有效的治愈方法。据流行病学调查结果显示，截至2018年，我国血友病患者数量约为13万，而真正能够做好预防性治疗的患者仅两成。凝血过程是一系列蛋白质的有限水解过程，一般分为三个阶段：凝血活酶形成、凝血酶形成和纤维蛋白形成。而血友病一般是在凝血的第一阶段即凝血活酶发生障碍，按照所缺乏的不同凝血因子通常可分为三类：A型血友病(因子
Ⅷ
缺乏)、B型血友病(因子
Ⅸ
缺乏)和C型血友病(因子
Ⅺ
缺乏)。发病率以A型血友病较多，约占85％；B型血友病约占15％；C型血友病则较少见。A型血友病为因子
Ⅷ
——抗血友病球蛋白(antihemophilic globulin,AHG)缺乏导致，相关基因定位于Xq28，基因跨度超过186kb，已发现有46种以上突变。B型血友病为因子
Ⅸ
——血浆凝血活酶成分(plasma thrombin component,PTC)缺乏导致，相关基因定位于Xq27.1，基因总长度为34kb左右，已鉴定出的突变有100种之多。C型血友病为因子
Ⅺ
——血浆凝血活酶前质(plasma thromboplastic antecedent deficiency,PTA)缺乏，相关基因定位于15q11，基因长度为23kb，现已发现3种突变。研究表明，在世界范围内，每5000名男性活婴中就有大约1人为A型血友病患者，B型血友病在每25000名男性中约有1人患病，而C型血友病种族倾向明显，多见于土耳其南部犹太人后裔，且遗传方式属常染色体隐性遗传。
[0003]血友病的治疗一般采用血液输注、凝血酶原复合物、凝血因子等手段，但血液制品存在着患者感染传染病的风险，凝血酶原复合物、凝血因子等蛋白制剂会导致患者产生针对这些蛋白的抗体，从而降低其治疗效果，甚至引起更严重的出血症状。因此，血友病动物模型的构建将在治疗研究中具有非常重要的作用。目前，关于血友病的动物模型以小鼠模型为主。早在20世纪90年代初，研究者就已依据基因打靶原理成功构建了小鼠的A型血友病模型。此后，B型血友病小鼠模型也被成功构建。但小鼠等啮齿类动物从体型、生理、病理等方面与人相差巨大，不能很好地模拟人类疾病，事实上，95％以上经小鼠验证有效的药物在人的临床试验中是无效的。因此，研发与人类体型及生理功能更近的大动物血友病模型是血友病治疗研究的关键。但目前尚未有任何人工构建的大动物血友病模型的报道。就大动物而言，灵长类是和人类亲缘关系最近的动物，但灵长类体型和器官大小与人相差较大，而且灵长类性成熟晚(猕猴初次交配年龄为6-7岁)，且为单胎动物，扩繁速度极慢。同时，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高，经济效益差，无法满足大规模的科研及商业需求。而猪是最适合作为疾病模型的动物，其体型大小、生理功能等与人非常接近，能很好地模拟人类的生理、病理特征。同时，猪性成熟早、繁殖周期短，一窝多胎、克隆技术成熟且成本较低，短时期内即可形成较大规模的群体。长期的近亲培育使猪的基因纯合度和遗传稳定性很高，遗传背景明确，表型相对稳定，在生物医学研究中的重复性好，符合科学研究的要求；同时，
小型猪易饲养，成本低，而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物不存在伦理等问题。
[0004]因此，用猪作为模型动物既可以克服大、小鼠等啮齿类动物与人种属差异较大的缺点，又可以克服灵长类动物成本高、繁殖周期长的缺陷，可以完全替代大、小鼠及灵长类模型动物，为广大药企、高校及科研院所提供性价比非常高的模式动物，将极大地促进生物医药的快速发展。
[0005]在此，我们通过基因编辑技术在猪原代成纤维细胞中对因子
Ⅷ
(F8)、因子
Ⅸ
(F9)基因分别造成单独突变和联合突变，得到F8、F9、F8&F9基因突变细胞，下一步运用克隆技术可得到A、B、A&B型三种血友病疾病模型猪，用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，为进一步的临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类血友病提供有力的实验手段。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对猪F8和F9基因各设计了一对靶点序列，利用该两对靶点序列构建了三种CRISPR/Cas9系统，将该三种CRISPR/Cas9系统分别转入猪成纤维细胞，筛选得到A、B及A&B型血友病模型猪细胞系。
[0007]本专利技术提供了gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用，所述gRNA靶点组合由第一gRNA靶点和第二gRNA靶点，和/或，第三gRNA靶点和第四gRNA靶点组成，
[0008]其中，所述第一gRNA靶点的碱基序列为TATAGTTGTGACAGGGACAT，第二gRNA靶点的碱基序列为CACAAGTCCAGAAGATGACG；
[0009]第三gRNA靶点的碱基序列为ATGCCACCAAAATTCTGCAT；第四gRNA靶点的碱基序列为AAACTGGAAGAGTTTGTTCG。
[0010]本专利技术还提供了双链DNA分子，包括粘性末端和靶点片段，所述靶点片段的碱基序列分别为：
[0011]TATAGTTGTGACAGGGACAT；
[0012]或CACAAGTCCAGAAGATGACG；
[0013]或ATGCCACCAAAATTCTGCAT；
[0014]或AAACTGGAAGAGTTTGTTCG。
[0015]本专利技术还提供了包含如所述双链DNA分子的表达盒或gRNA表达载体。
[0016]本专利技术还提供了一种CRISPR/Cas9系统，包括第一gRNA表达载体、第二gRNA表达载体和Cas9表达载体，所述第一gRNA表达载体的靶点序列为TATAGTTGTGACAGGGACAT，所述第二gRNA的靶点序列为CACAAGTCCAGAAGATGACG。
[0017]可选的，所述第一gRNA表达载体、第二gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1.5～2:1.5～2:1。进一步可选的，所述第一gRNA表达载体、第二gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1.5:1.5:1。
[0018]本专利技术还提供另一种CRISPR/Cas9系统，包括第三gRNA表达载体、第四gRNA表达载体和Cas9表达载体，所述第三gRNA表达载体的靶点序列为ATGCCACCAAAATTCTGCAT，所述第四gRNA表达载体的靶点序列为AAACTGGAAGAGTTTGTTCG。
[0019]可选的，所述第三gRNA表达载体、第四gRNA表达载体和Cas9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用，所述gRNA靶点组合由第一gRNA靶点和第二gRNA靶点，和/或，第三gRNA靶点和第四gRNA靶点组成，其特征在于，其中，所述第一gRNA靶点的碱基序列为TATAGTTGTGACAGGGACAT，第二gRNA靶点的碱基序列为CACAAGTCCAGAAGATGACG；第三gRNA靶点的碱基序列为ATGCCACCAAAATTCTGCAT；第四gRNA靶点的碱基序列为AAACTGGAAGAGTTTGTTCG。2.双链DNA分子，包括粘性末端和靶点片段，其特征在于，所述靶点片段的碱基序列分别为：TATAGTTGTGACAGGGACAT；或CACAAGTCCAGAAGATGACG；或ATGCCACCAAAATTCTGCAT；或AAACTGGAAGAGTTTGTTCG。3.包含如权利要求2所述双链DNA分子的表达盒或gRNA表达载体。4.CRISPR/Cas9系统，包括第一gRNA表达载体、第二gRNA表达载体和Cas9表达载体，其特征在于，所述第一gRNA表达载体的靶点序列为TATAGTTGTGACAGGGACAT，所述第二gRNA表达载体的靶点序列为CACAAGTCCAGAAGATGACG。5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述第一gRNA表达载体、第二gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1.5～2:1.5～2:1。6.CRISPR/Cas9系统，包括第三gRNA表达载体、第四gRNA表达载体和Cas9表达载体，其特征在于，所述第三gRNA表达载体的靶点序列为ATGCCACCAAAATTCTGCAT，所述第四gRNA表达载体的靶点序列为AAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，王德华，王磊，程锐，曾为俊，马翔，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：