本发明专利技术涉及一种基因敲除小鼠模型及其构建方法，属于动物模型及其应用领域。其方法流程包括sgRNA和Cas9 RNA的获得；UOX突变胚胎的获得及移植；基因敲除小鼠鉴定；纯合品系构建。方法步骤具体为UOX基因第三外显子前后两个位点设计双sgRNA，通过PCR、体外转录和纯化获得sgRNA和Cas9 mRNA。sgRNA和Cas9 mRNA显微注射至小鼠原核胚，体外培养至二细胞胚或桑椹胚阶段，胚胎移植至代孕母鼠。F0代小鼠出生后，提取其DNA进行电泳分析和测序分析。F0代交配繁殖至F2代获得UOX缺失的小鼠纯合品系。本发明专利技术构建模型的时间较短，模型变异性小，引起并发症可能性小，模型有效时间增加。并且小鼠模型饲养简单、操作方便、与人同属哺乳动物，生理生化特性与人接近。特性与人接近。特性与人接近。
【技术实现步骤摘要】
UOX基因敲除小鼠模型及其构建方法
[0001]本专利技术涉及一种基因敲除小鼠模型及其构建方法，属于动物模型及其应用领域。
技术介绍
[0002]高尿酸血症是由嘌呤代谢紊乱，尿酸排泄障碍引起的血尿酸异常为临床表现的异质性疾病。高尿酸血症易引起痛风、关节变形、慢性间质肾炎，严重影响患者生活质量及行动能力。并且，高尿酸血症易引发并发症。目前尚未有根治高尿酸血症和痛风的药物，新型降尿酸药物开发需要利用高尿酸动物模型进行降尿酸药物药效及药理筛选。故建立稳定性好，更接近患者发病特征的高尿酸动物模型，能提高新型降尿酸药物开发效率及成药性，深化高尿酸血症和痛风发病机制研究，及优化高尿酸血症和痛风治疗格局。
[0003]现有技术中，如中国专利申请号：CN201811154393，公开了一种痛风性关节炎动物模型的构建方法，该专利技术选择SPF鸡作为实验动物，通过高蛋白高钙饲料喂养建立高尿酸血症模型，将尿酸盐晶体混悬液注入高尿酸血症模型鸡的膝关节腔，包括以下步骤：(1)尿酸盐结晶混悬液的制备；(2)高尿酸血症基础动物模型的建立；(3)痛风性关节炎动物模型的建立。再如中国专利申请号：CN201711312406，公开了一种大鼠持续性高尿酸血症模型的复制方法。该方法步骤具体为将选取的健康大鼠于清洁级的动物饲养室进行适应性喂养1周，将形态特征正常的大鼠用于模型的建立；针对形态特征正常的大鼠，每天于室温下用腹腔注射给药的方式，给予500mg
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kg-1的尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾，同时24h不间断的给予10％的果糖饮水以及充足的饮食。每日连续对大鼠给药造模，持续给药3周。以上模型选择了鸡和大鼠，模型使用的操作难度大。而且，直接注入诱导剂至动物体内构建高尿酸模型的方法，构建的高尿酸模型耗时长，个体变异性大，主观干扰性强，易引起肾损伤及高尿酸模型维持不稳定持久等缺陷。采用高蛋白、高嘌呤、高糖等饮食调整诱发高尿酸动物模型，具有模型间变异性大，易引起并发症，耗时较长的缺点。因此以上问题亟待解决。
[0004]近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术凭借其简便性、特异性和高效性，在疾病动物模型构建领域应用日趋广泛和深入。CRISPR/Cas9系统主要部件为RNA引导的有规则间隔的短回文重复序列sgRNA，sgRNA能引导Cas9酶切蛋白双链断裂目的基因特定位点。非同源性末端接合参与修复DNA双链断裂产生突变等位基因。CRISPR/Cas9系统用于基因敲除技术发展时间长，具有高效、专一和成熟等优点。故本专利技术采用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠体内的UOX基因，以构建高尿酸血动物模型。小鼠UOX基因表达的UOX蛋白催化尿酸分解为尿囊素。人体内UOX基因在进化过程中突变沉默，尿酸成为嘌呤代谢终末产物直接排泄。若成功基因敲除小鼠UOX基因，可使尿酸累积形成高尿酸血模型。
技术实现思路
[0005]为解决现有技术存在的模型间变异性大，主观干扰性强，易引起并发症，建模耗时较长，使用有效时间短，操作不方便，生化特性与人差异大的缺陷。
[0006]本专利技术提供一种UOX基因敲除小鼠模型。
[0007]本专利技术还提供一种UOX基因敲除小鼠模型的构建方法。
[0008]本专利技术还提供一种UOX基因敲除小鼠模型在高尿酸血症及痛风疾病的应用。
[0009]为达到上述目的，本专利技术采取如下技术手段：
[0010](1)选取UOX基因(NCBI Gene ID：22262)编辑。根据UOX基因第三号外显子功能域的前部和后部分别设计两条sgRNA，设计PCR上游引物UOX-sgRNA-1、UOX-sgRNA-2，下游引物。分别将UOX-sgRNA-1、UOX-sgRNA-2和T7SG-R0混合，加入扩增试剂和质粒载体混合后进行两次PCR扩增两个sgRNA模板。反应条件均为98℃预变性5min；按循环程序(98℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s)进行35个循环；72℃延伸5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收纯化琼脂糖凝胶内DNA。混合缓冲液、ATP、TTP、CTP、GTP、sgRNA模板、T7酶、无核酸酶水，37℃孵育2h体外转录，加DNase 1μL，37℃孵育15min；纯化得到sgRNA。
[0011]所述步骤(1)中引物为：
[0012]UOX-sgRNA-1：5
’-
ATTGCTAGCGTGGTTTGTGC-3
’
[0013]UOX-sgRNA-2：5
’-
GGGCTCAAGGGACCTCACACGTC-3
’
[0014]T7SG-R0：5
’-
AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3
’
[0015](2)用正向引物和反向引物通过PCR扩增Cas9 DNA。反应条件为98℃预变性5min；按循环程序(98℃30s，60℃30s，72℃30s)进行35个循环；72℃延伸5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。回收胶内Cas9 DNA。纯化、体外转录为Cas9 mRNA。纯化Cas9 mRNA。
[0016]所述步骤(2)中引物为：
[0017]正向引物：5
’-
TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3
’
[0018]反向引物：5
’-
GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3
’
[0019](3)若干只雌鼠超排促卵注射，与雄鼠合笼一夜。见栓雌鼠实施安乐死，手术从输卵管收集卵丘细胞复合体。卵丘细胞复合体用M2培养基洗涤培养原核胚。
[0020](4)在显微镜下用显微注射针向原核胚内注射Cas9 mRNA和sgRNA，继续培养胚胎至两细胞胚或桑椹胚，观察胚胎的卵裂和囊胚发育情况。
[0021](5)结扎雄鼠与发情的雌鼠合笼，选取见栓后0.5天或2.5天雌鼠作为代孕母鼠，在显微镜下将胚胎移从输卵管移植入代孕母鼠子宫。
[0022](6)代孕母鼠生产F0代小鼠。出生后分开饲养雄鼠和雌鼠。取出生后3周F0代小鼠鼠尾DNA，设计两个正向验证引物和一个反向验证，用PCR验证基因敲除情况。PCR反应条件为95℃预变性5min；按循环程序(95℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 40s)进行30个循环；68℃延伸5min。纯化克隆PCR产物，反应产物测序分析。
[0023]所述步骤(6)中引物为：
[0024]UOX-Check-1F：AAGCCACTCCATCTTTGTCC
[0025]UOX-Check-1R：CAAAAGACACCTGCCGACT
[0026]UOX-Check-2F：CGAGACCTTTGCAATGAACA
[0027](7)将F0代的基因敲除小鼠与野生型小鼠交配获得后代F1，对F1代小鼠进行突变分析。选择突变的F1代杂合雌鼠和雄鼠交配获得后代F2，对F2代小鼠进行突变分析。对F2代中纯合本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种UOX基因敲除小鼠模型，其特征在于，UOX基因部分敲除。2.一种UOX基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/CAS9系统靶向切割UOX基因，包括如下步骤：(1)根据小鼠UOX基因第三外显子功能域的前部和后部分别设计引物，通过PCR、体外转录和纯化获得sgRNA和Cas9 mRNA；(2)雌鼠超排出卵，与雄鼠交配。从输卵管收集卵丘细胞复合体。将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射进单个小鼠原核胚，体外培养至二细胞或桑椹胚阶段。将胚胎移植至代孕母鼠子宫内孕育；(3)FO代小鼠出生后，提取DNA进行电泳分析、突变分析和测序分析；(4)筛选出UOX基因敲除杂合子小鼠，通过交配和突变分析筛选到纯合UOX基因敲除小鼠。3.根据权利要求2所述的一种UOX基因敲除小鼠模型的构建方法，所述步骤(1)的引物为：UOX-sgRNA-1：5
’-
ATTGCTAGCGTGGTTTGTGC-3
’
UOX-sgRNA-2：5
’-
GGGCTCAAGGGACCTCACACGTC-3
’
T7SG-RO：5
’-
AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3
...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏海林，黄晶，张茹君，
申请(专利权)人：常州卡文斯实验动物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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