一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用。包含可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适配体发生多价结合，释放识别探针中的引发链；引发链侵入信号探针，通过结合Toehold区域Ⅰ，驱动链的分支迁移释放出淬灭链，解放荧光报告基团，并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ；燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ，启动Toehold介导的链置换循环反应，发生连续的分支迁移和多价回收。可实现外泌体的超灵敏定量检测；可实现外泌体表面两种或多种蛋白标志物的双色或多色分析；操作简单，耗时短，样品消耗量少，灵敏度高、特异性好。特异性好。特异性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用


[0001]本专利技术属于快速检测
，具体涉及一种外泌体或外泌体表面蛋白驱动的DNA纳米分子机器，其可用于外泌体及表面蛋白的定性和定量分析。它具有多价循环扩增的信号响应机制，能用于对肿瘤外泌体和外泌体表型分子的超灵敏检测。

技术介绍

[0002]近些年来，精准医学的液体活检技术被广泛用于肿瘤的早期筛查，辅助诊断，疗效监测和药效预测。与传统的组织活检相比，液体活检具有无创性，能实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。
[0003]目前的临床研究中，液体活检技术主要包括游离循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、外泌体检测等。外泌体是一种直径范围为30-150nm的双层磷脂膜封装的微囊泡，可来源于各种类型的细胞，包括淋巴细胞，神经细胞，上皮细胞和各种肿瘤细胞等。细胞内多囊泡体与胞膜通过内吞、融合、外排等过程向胞外分泌外泌体，释放到各种体液中。外泌体膜表面及囊泡内存在有多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和DNA片段，还包括一些小分子RNA，如miRNA、lncRNA和mRMA等。藉由外泌体的转运，一些生物信息分子可以激活细胞表面受体，外泌体内容物可进入靶细胞内，对靶细胞起调节作用。因此，外泌体可参与免疫应答、抗原提呈和细胞间通讯等多种生理过程。肿瘤细胞来源的外泌体通过介导肿瘤细胞与周围及远端的组织或基质细胞之间的信息传递，可以实现对肿瘤细胞的增殖、转移以及肿瘤耐药等生物学行为的调控。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源，从这些体液中分离提取外泌体，对其携带的肿瘤特异性表型蛋白和核酸分子进行鉴定和定量，有助于肿瘤的早期诊断，治疗监测和预后判断。
[0004]迄今为止，研究人员根据外泌体的生物学特征开发出多种外泌体的检测方法，常用的传统方法包括酶联免疫吸附技术(ELISA)和蛋白免疫印迹技术(Western blot)等，但是这些方法步骤繁琐，对操作者有较高的技能要求。近些年来，以流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)为代表的生物颗粒计数技术以及表面等离子体共振(SPR)、表面增强拉曼光谱技术(SERS)、场效应晶体管(FET)和电化学分析等生物传感平台也被广泛应用于外泌体的检测，并具有较好的检测性能。然而这些方法都依赖于昂贵的仪器设备，生物传感器件的制备还需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程，并且大多数生物传感技术需要昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件，难以在临床实验室广泛开展。因此，我们急需开发出一种简单易行、价格低廉，适用于临床实验室的外泌体检测方法。荧光分析是临床上一种常规的检测平台，具有仪器成本低、操作简便等优点，近年来，已有报道采用荧光分析策略的外泌体的检测方案，并且取得了不同程度的成功。如刘映昕等采用上转换纳米材料(UCNPs)与金纳米棒(Au NRs)之间的荧光共振能量转移效应来检测外泌体。王慧等利用氧化石墨烯对单链荧光适配体的吸附和荧光淬灭效应来检测外泌体。这些方法虽然有效，但灵敏度相对较低，且不能实现同时对外泌体进行定量和表型分析。
[0005]因此，一种能够进行外泌体及其表面蛋白的定量和表型分析，灵敏度高的且成本
低廉的快速检测系统亟待开发。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的是针对现有技术的不足：现有外泌体或表面蛋白检测的分析步骤繁琐，仪器设备昂贵，灵敏度不高等问题，而提供一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器、基于DNA纳米分子机器的外泌体及其表面蛋白分析荧光生物传感系统。其用于外泌体或表面蛋白检测的分析灵敏度高，可同时实现定量和表型分析，并可用于多外泌体和/或表面蛋白的分析。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]提供一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器，包括识别探针、信号探针和燃料探针；
[0009]识别探针是由引发链a与核酸适配体序列部分杂交形成的双链DNA结构，所述核酸适配体是指可与外泌体表面蛋白标志物特异识别结合的单链DNA；
[0010]信号探针是由三条DNA单链通过杂交反应自组装而成的双链DNA结构，三条DNA单链分别是：中间修饰有荧光报告基团的信号链d、末端修饰有荧光淬灭基团的淬灭链b和保护链c，淬灭链b和保护链c分别与信号链d上相邻两个区域互补杂交，且淬灭链b和保护链c间无碱基间隔，淬灭链b末端修饰的荧光淬灭基团和信号链d中间修饰的荧光报告基团对应位于双链间互补的碱基对上，信号链d上靠近淬灭链b的一端有一段未杂交序列，形成一个粘性末端，作为第一Toehold区域，介导由引发链a侵入引起的链置换反应；在信号探针中部荧光基团修饰位点区域隐藏有第二Toehold区域，介导由燃料链驱动的循环链置换反应的发生；
[0011]燃料探针是一条与信号链d序列互补的DNA单链，即燃料链e，其与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上的荧光报告基团修饰位点，其序列长度长于淬灭链b和保护链c。
[0012]按上述方案，引发链a和信号链d上粘性末端以及信号长链上杂交淬灭链b的一部分杂交，引发链a、保护链c和信号链d杂交形成的双链结构中的单链部分为隐藏的第二Toehold区域；所述的燃料链e与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上隐藏的第二Toehold区域。
[0013]进一步地，所述的外泌体及其表面蛋白包括CD81、CD9、CD63、PD-L1、EpCAM、PTK-7、PSMA、PDGF、AFP、CEA、GPC-1等。
[0014]按上述方案，所述的外泌体表面蛋白为CD63,各探针序列如下表1所示，
[0015]表1CD63识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
[0016][0017]按上述方案，所述的外泌体表面蛋白为PD-L1,各探针序列如下表2所示：
[0018]表2PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
[0019][0020][0021]进一步地，荧光报告基团为FAM、Cy3、Cy5等，对应的荧光淬灭基团分别为BHQ1、BHQ2、BHQ2等。
[0022]进一步地，所述的DNA纳米分子机器含有多组分别与不同待检测外泌体表面蛋白
标志物相对应的识别探针、信号探针和燃料探针，每组中的信号探针上修饰的荧光报告基团不同，用于多外泌体和/或外泌体表面蛋白的分析检测。所述荧光报告基团不同，主要指其该荧光报告基团对应的荧光激发波长和发射波长不同，互不干扰，避免多外泌体表面蛋白的分析检测中的干扰。
[0023]DNA纳米分子机器的制备方法，包括以下步骤：
[0024](1)识别探针的制备：将核酸适配体和引发链a加入到一定体积连接反应缓冲液中，加热变性使DNA链打开局部二级结构，迅速降温至室温，使得两条寡核苷酸链杂交为识别探针，可4℃下保存备用；
[0025](2))信号探针的制备：将淬灭链b、信号链d和保护链c加入到链置换反应缓冲液中，混匀，使三条寡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器，其特征在于：包括识别探针、信号探针和燃料探针；识别探针是由引发链a与核酸适配体序列部分杂交形成的双链DNA结构，所述核酸适配体是指可与外泌体表面蛋白标志物特异识别结合的单链DNA；信号探针是由三条DNA单链通过杂交反应自组装而成的双链DNA结构，三条DNA单链分别是：中间修饰有荧光报告基团的信号链d、末端修饰有荧光淬灭基团的淬灭链b和保护链c，淬灭链b和保护链c分别与信号链d上相邻两个区域互补杂交，且淬灭链b和保护链c间无碱基间隔，淬灭链b末端修饰的淬灭基团和信号链d中间修饰的报告基团对应位于双链间互补的碱基对上，信号链d上靠近淬灭链b的一端有一段未杂交序列，形成一个粘性末端，作为第一Toehold区域，介导由引发链a侵入引起的链置换反应；在信号探针中部荧光基团修饰位点区域隐藏有第二Toehold区域，介导由燃料链驱动的循环链置换反应的发生；燃料探针是一条与信号链d序列互补的DNA单链，即燃料链e，其与信号链d互补杂交区域涵盖信号链d上的荧光报告基团修饰位点，序列长度长于淬灭链b和保护链c。2.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：引发链a和信号链d上粘性末端以及信号长链上杂交淬灭链b的一部分杂交，引发链a、保护链c和信号链d杂交形成的双链结构中的单链部分为隐藏的第二Toehold区域；所述的燃料链e与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上隐藏的第二Toehold区域。3.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：所述的外泌体及其表面蛋白包括CD81、CD9、CD63、PD-L1、EpCAM、PTK-7、PSMA、PDGF、AFP、CEA、GPC-1。4.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：所述的外泌体表面蛋白为CD63，各探针序列如下表1所示，表1
所述的外泌体表面蛋白为PD-L1,各探针序列如下表2所示：表2 PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列5.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：荧光报告基团为FAM、Cy3、Cy5等，对应的荧光淬灭基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，张国军，金丹，
申请(专利权)人：湖北中医药大学，
类型：发明
国别省市：