一种基于DNAwalker的电化学生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物传感器技术领域，涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用；首先将DNA walker

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素(AFs)是呋喃环类毒素，广泛存在于农业生产，加工和运输中。由于真菌毒素(例如AFs)具有很高的肝毒性和对人致癌性，因此被分类为I类人类致癌物。许多国家和世界组织对自动对焦提出了严格的要求，例如食品中AF的最大残留限量为15ng mL-1
。其中黄曲霉毒素B1(AFB1)已被证实是极其危险的。并开发了许多公认的先进分析技术来检测AFB1，例如高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FL)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是，这些方法操作复杂，成本高，准确性不足或受存在假阳性结果的限制。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。
[0003]电化学方法以其简单，快速响应和低成本等优点而受到了广泛的关注。已经构建了用于灵敏检测AF的各种电化学传感器，例如用于AFB1分析的基于多功能DNA纳米管的电化学传感器，以及通过常规电化学方法相结合的双模式传感器；但是由于单信号输出容易受环境因素的影响，而且灵敏度和精确度不足。
[0004]为了顺应真菌毒素检测更灵敏更精准的宗旨，我们构建了一种基于DNA walker这种分子步行机器实现电化学信号放大的适配体传感器用于高灵敏检测黄曲霉毒素B1。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种检测速度快，灵敏度高的电化学检测器件，用于直接检测AFB1。本专利技术使用DNA链在电极表面的自组装过程，目标物的出现启动DNA链的自组装行走过程，并在第一次放大的基础上，进行杂交链式反应进行DNA链的扩增，扩增后的产物为长双链DNA，可以吸附大量的信号分子亚甲基蓝，通过交流循环伏安法进行分析检测，获取被两次放大后的电化学信号，用于检测黄曲霉毒素B1。
[0006]通过如下技术方案实现本专利技术的目的：
[0007]本专利技术首先提供一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：
[0008](1)首先将DNA walker溶液和AFB1适配体溶液混合，得到的混合溶液于一定温度的水浴条件下进行反应，水浴反应后冷却至室温，得到DNA walker-AFB1适配体溶液；
[0009](2)取步骤(1)制备的DNA walker-AFB1适配体溶液与发夹DNA1溶液和发夹DNA2溶液混合，得到混合溶液，记为混合溶液A；取混合溶液A滴加到Au电极表面，固定反应一段时间；依靠DNA末端修饰的-SH，利用Au-S键结合作用力，将三种DNA链固定在电极表面；
[0010]然后再将巯基己醇(MCH)滴加到Au电极表面，常温孵育一段时间，得到基于DNA walker的电化学生物传感器。
[0011]进一步地，步骤(1)中，所述DNA walker溶液的浓度为0.1μM，AFB1适配体溶液的浓度为0.15μM；所述水浴条件的温度为90-95℃，反应时间为5min。
[0012]进一步地，步骤(2)中，所述混合溶液A中DNA walker-AFB1的最终浓度为0.1μM，发夹DNA1的最终浓度为0.5-10μM、发夹DNA2的最终浓度为0.5-10μM。
[0013]优选的，所述发夹DNA1的最终浓度为5μM，发夹DNA2的最终浓度为5μM。
[0014]进一步地，步骤(2)中，所述混合溶液A滴加到Au电极表面的用量为6μL；所述固定反应一段时间为12h；所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到Au电极表面的用量为8μL；所述常温孵育一段时间为30-80min。
[0015]优选的，所述常温孵育一段时间为60min。
[0016]本专利技术还涉及一种基于DNA walker的电化学生物传感器检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：
[0017](1)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓度V1体积的AFB1溶液，常温孵育一段时间，得到已完成识别检测的电化学生物传感器界面；一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
[0018](2)然后，将锚定探针1溶液、短链DNA1溶液、短链DNA 2溶液混合，得到混合溶液B，再取混合溶液B分别修饰到步骤(1)中已完成识别检测的电化学生物传感器表面进行反应；反应后，将电化学生物传感器分别浸泡在亚甲基蓝溶液中，浸泡一段时间，得到浸泡处理的电化学生物传感器；
[0019](3)用三电极体系(Au工作电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)在CHI852D电化学工作站上选择交流伏安法(ACV)检测步骤(2)中浸泡处理的电化学生物传感器界面的电流，传感器表面由于吸附的大量亚甲基蓝，交流伏安法测量表面吸附的亚甲基蓝在氧化还原过程中产生的电流强度；电流强度与AFB1溶液的浓度正相关，每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
[0020](4)样品中AFB1的检测：将样品处理后得到样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，常温孵育后按照步骤(2)进行操作，然后测定电流值；将电流值代入步骤(3)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中黄曲霉毒素B1检测的用途。
[0021]进一步地，步骤(2)中，所述AFB1溶液的浓度为0.01-10pg mL-1
，修饰的用量为6μL；所述常温孵育一段时间为30-80min。
[0022]优选的，所述常温孵育一段时间为60min。
[0023]进一步地，步骤(2)中，所述锚定探针1溶液、短链DNA1溶液和短链DNA 2溶液的体积比为1:1:1；所述混合溶液B中锚定探针1溶液最终浓度为0.1μM，短链DNA1溶液的最终浓度为5μM，短链DNA2溶液的最终浓度为5μM；所述混合溶液B修饰到电化学生物传感器表面的用量为8μL；所述反应的时间为60-120min。
[0024]优选的，所述反应的时间为100min。
[0025]进一步地，步骤(2)中，所述亚甲基蓝溶液的浓度为1μM；所述浸泡一段时间为10-20分钟。
[0026]进一步地，步骤(4)中，所述常温孵育的时间为30-80min。
[0027]进一步地，步骤(1)和(4)中V1修饰的体积为6μL。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029](1)本专利技术的电化学生物传感器构筑简单，无毒。
[0030](2)本专利技术利用DNA自组装过程高效，准确的特性构建了一个可以在电极表面依次进行DNA自组装行走和DNA杂交链式反应的传感器。
[0031](3)本专利技术利用DNA双链可以高效吸附亚甲基蓝小分子这种电化学探针的特性，实现了电化学信号的双重放大，有效提高了检测的灵敏度。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)首先将DNA walker溶液和AFB1适配体溶液混合，得到的混合溶液于一定温度的水浴条件下进行反应，水浴反应后冷却至室温，得到DNA walker-AFB1适配体溶液；(2)取步骤(1)制备的DNA walker-AFB1适配体溶液与发夹DNA1溶液和发夹DNA2溶液混合，得到混合溶液，记为混合溶液A；取混合溶液A滴加到Au电极表面，固定反应一段时间；依靠DNA末端修饰的-SH，利用Au-S键结合作用力，将三种DNA链固定在电极表面；然后再将巯基己醇滴加到Au电极表面，常温孵育一段时间，得到基于DNA walker的电化学生物传感器。2.根据权利要求1所述的基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA walker溶液的浓度为0.1μM，AFB1适配体溶液的浓度为0.15μM；所述水浴条件的温度为90-95℃，反应时间为5min。3.根据权利要求1所述的基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合溶液A中DNA walker-AFB1的最终浓度为0.1μM，发夹DNA1的最终浓度为0.5-10μM、发夹DNA2的最终浓度为0.5-10μM。4.根据权利要求3所述的基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述发夹DNA1的最终浓度为5μM，发夹DNA2的最终浓度为5μM。5.根据权利要求1所述的基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合溶液A滴加到Au电极表面的用量为6μL；所述固定反应一段时间为12h；所述巯基己醇的浓度为1mM，滴加到Au电极表面的用量为8μL；所述常温孵育一段时间为30-80min。6.根据权利要求5所述的基于DNA walker的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述常温孵育一段时间为60min。7.根据权利要求1-6任一所述的电化学生物传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：(1)取多个上述步骤中已经构建的电化学生物传感器，在其表面分别修饰不同浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：由天艳，贾帆，刘东，孟淑云，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：