一种基于DNA酶的纸传感器、制备方法及其在检测RNaseH中的应用技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA酶的纸传感器，包括尼龙膜和固定在尼龙膜上的G

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA酶的纸传感器、制备方法及其在检测RNase H中的应用


[0001]本专利技术属于生物化学
，特别提供了一种基于DNA酶的纸传感器、制备方法及其在检测RNase H中的应用。

技术介绍

[0002]RNase H是一种内源性的核糖核酸内切酶，其几乎存在于从病毒到人类的所有生物中。RNase H能够特异性地水解DNA/RNA双链中RNA上的磷酸二酯键。研究发现，RNase H不仅会参与DNA的复制和修复，还会参与许多病毒的逆转录及抗肿瘤过程，如：RNase H可以作为抗-免疫缺陷病毒(HIV)的有效药物(当RNase H具有活性时，HIV和其它逆转录病毒才能繁殖，如果使HIV逆转录酶的RNase H区域发生突变，则酶活性降低，HIV毒性丧失)。
[0003]目前，用于定量检测RNase H活性的方法有凝胶或毛细管电泳、RNA的酸性释放、HPLC等。然而，这些传统的方法有一定的缺点，如耗时、有毒、特异性低、检测限高等。为了克服这些问题，虽然已经有科学家提出了几种荧光的方法用于RNase H检测，但是这些方法存在多种缺陷，比如操作不够简便，同时还非常依赖于大型昂贵的仪器分析，这将极大地限制这些方法在实际体系或资源匮乏环境下的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种基于DNA酶的纸传感器、制备方法及其在检测RNase H中的应用。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
[0006]一种基于DNA酶的纸传感器，包括尼龙膜和固定在所述尼龙膜上的G-DNA/Cp-RNA双链探针。
[0007]上述的纸传感器，优选的，所述G-DNA包含核苷酸序列：5
’-
GGGTAGGGCGGGTTGGGT-3
’
(如SEQ ID NO.1所示)，所述Cp-RNA包含核苷酸序列：5
’-
ACCCAACCCGCCCUACCC-3
’
(如SEQ ID NO.2所示)。
[0008]优选的，所述尼龙膜的大小为1cm
×
1cm。
[0009]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的纸传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0010](1)将Cp-RNA加入到含G-DNA及缓冲液的混合溶液中反应，形成G-DNA/Cp-RNA双链探针；
[0011](2)将所述步骤(1)得到的G-DNA/Cp-RNA双链探针溶液滴加在尼龙膜的表面，并加入封闭液封闭后，即得到所述的纸传感器。
[0012]上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，所述G-DNA与Cp-RNA的摩尔比为1:(1～1.4)，更优选为1:1.2；所述缓冲液为包含20mM pH 7.8 Tris-HCl、140mM KCl和10mM MgCl2的混合溶液。
[0013]优选的，所述步骤(1)中，所述含G-DNA及缓冲液的混合溶液在参与反应前先于70～95℃退火5～20min，然后于0℃孵育30min；所述反应的温度为25～38℃，所述反应的时间为1～2h。
[0014]优选的，所述步骤(2)中，所述封闭液包括体积浓度为0.2％的Triton X-100、体积浓度为5％的Smp、体积浓度为0.2％的Tween 20和体积浓度为0.2％的Tween 80中的任意一种，更优选为体积浓度为5％的Smp；所述封闭的时间为1～2h；制备得到的纸传感器置于4℃下储存备用。
[0015]基于一个总的专利技术构思，本专利技术上述的纸传感器在检测RNase H中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0016]步骤1：往所述的纸传感器中加入无细胞提取物样品溶液，进行孵育；
[0017]步骤2：加入氯化血红素(hemin)溶液后，进行孵育；
[0018]步骤3：将所述步骤2后得到的纸传感器取出，往其表面滴加底物，进行孵育后，检测纸传感器的颜色，即实现无细胞提取物样品溶液中RNase H含量的检测。
[0019]上述的应用，优选的，所述步骤1中，所述无细胞提取物样品溶液的浓度为1.25μL 1.6
×
107Cell/μL；所述无细胞提取物样品溶液中含有8
×
106个正常细胞L02、肿瘤细胞Hela、肿瘤细胞Hep G2和肿瘤细胞MCF-7中的任意一种或多种；
[0020]所述步骤2中，所述氯化血红素溶液的浓度为2μM；所述氯化血红素溶液包括25mM pH 8.0 Tris-HCl和体积浓度为0.05％的Triton X-100；
[0021]所述步骤3中，所述底物为ABTS和TMB中的任意一种。
[0022]优选的，所述步骤1、步骤2和/或步骤3中，所述孵育的温度为25～38℃(更优选为34～38℃)，时间为1～2h。
[0023]本专利技术的技术原理如下：
[0024]如图1所示，本专利技术通过强静电作用将带负电荷的DNA/RNA双链(DNA链富含鸟嘌呤，RNA链与该DNA链碱基互补)固定在带正电荷的尼龙膜上，在存在RNase H的情况下，G-DNA/Cp-RNA双链上的RNA链会被RNase H降解，使G-DNA序列单独留在膜表面，表现出了优良的选择性。并且在添加hemin后形成类似HRP性质的G-四联体/hemin复合物的DNA酶具有很好的信号放大能力，因此，这种纸传感器表现出高灵敏度。然后，形成的这种DNA酶能够催化底物(ABTS或TMB)发生氧化还原反应，从而诱导颜色的变化，进而实现RNase H的检测。
[0025]无细胞提取物样品溶液中RNase H的成功定量验证了我们提出的纸传感器能够分析检测复杂生物样品中RNase H。这些结果表明，这种新型的纸传感器有望成为一种非常有用的生物技术工具，并用于涉及RNase H水平变化的疾病的基础研究和临床诊断。本专利技术的方法操作简单、检测快速且灵敏度高，对RNase H的检测限(LOD)为1.2U/mL，本专利技术检测RNase H具有非常高的特异性。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0027]1、本专利技术的基于DNA酶的纸传感器，能够简单、快速、准确地分析检测复杂生物样品中的RNase H含量，对RNase H具有非常高的特异性，灵敏度高，对RNase H的检测限(LOD)为1.2U/mL；这种新型的纸传感器有望成为一种非常有用的生物技术工具，并用于涉及RNase H水平变化的疾病的基础研究和临床诊断。
[0028]2、本专利技术的制备方法，操作简单，制备成本低廉。
[0029]3、本专利技术应用方法，操作简单、检测快速且灵敏度高，且不需要依赖大型昂贵的仪器就可实现肉眼定性检测RNase H活性，成本低，可以广泛应用于生物、医学检测领域。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA酶的纸传感器，其特征在于，包括尼龙膜和固定在所述尼龙膜上的G-DNA/Cp-RNA双链探针。2.根据权利要求1所述的纸传感器，其特征在于，所述G-DNA包含核苷酸序列：5
’-
GGGTAGGGCGGGTTGGGT-3
’
，所述Cp-RNA包含核苷酸序列：5
’-
ACCCAACCCGCCCUACCC-3
’
。3.根据权利要求1或2所述的纸传感器，其特征在于，所述尼龙膜的大小为1cm
×
1cm。4.一种如权利要求1-3中任一项所述的纸传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将Cp-RNA加入到含G-DNA及缓冲液的混合溶液中反应，形成G-DNA/Cp-RNA双链探针；(2)将所述步骤(1)得到的G-DNA/Cp-RNA双链探针溶液滴加在尼龙膜的表面，并加入封闭液封闭后，即得到所述的纸传感器。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述G-DNA与Cp-RNA的摩尔比为1:(1～1.4)；所述缓冲液为包含20mM pH 7.8Tris-HCl、140mM KCl和10mM MgCl2的混合溶液。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述含G-DNA及缓冲液的混合溶液在参与反应前先于70～95℃退火5～20min，然后于0℃孵育30min；所述反应的温度为25～38℃，所述反应的时间为1～2h。7.根据权利要求4所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓婷，谢烨，张思娜，李继山，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，
类型：发明
国别省市：