利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法及其应用。本发明专利技术通过将短链醇、盐和水混合得到双水相体系；然后在双水相体系中加入鱼肉肌原纤维蛋白或是鱼肉肌原纤维蛋白溶液，混匀，得到双水相分离提取体系，当双水相分离提取体系再次出现分层后，取上相，得到鱼类肌动蛋白溶液。本发明专利技术还包括用毛细管定量鱼类肌动蛋白的步骤。本发明专利技术提取率高，纯度高，从而可用于鱼类肌动蛋白生产或是鱼类肌动蛋白标准品制备。动蛋白标准品制备。动蛋白标准品制备。

【技术实现步骤摘要】
利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法及其应用


[0001]本专利技术属于天然产物的分离纯化
，尤其涉及一种利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法及其应用。

技术介绍

[0002]鱼肉主要由蛋白质和脂肪构成，鱼类肌肉蛋白质含量高达18％-22％以上，高于猪肉20.2％、牛肉19.8％、羊肉15.5％等禽类的蛋白质含量。鱼类肌肉中的蛋白质主要有肌原纤维蛋白约占总蛋白含量的55％-60％，是鱼肌肉中含量最高的蛋白质，适宜的加工处理可以使其形成稳定的网络结构，从而赋予肉制品良好的凝胶特性和感官特性，主要包括起收缩作用的肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等；肌浆蛋白占总蛋白的30％-34％，主要包括肌白蛋白、球蛋白和酶类等多种蛋白；基质蛋白是结缔组织蛋白质，含量约为10％-15％，包括胶原蛋白、网状蛋白及黏蛋白等。肌动蛋白(Actin)是细胞骨架的组成部分，是构成肌肉细丝的主要成分，约占肌原纤维蛋白的20％，单体肌动蛋白分子量约为42kDa，由375-377个氨基酸组成。在肌肉细胞中，肌动蛋白细丝参与肌肉收缩。在非肌细胞中，肌动蛋白通过单体(G-肌动蛋白)和聚合体(F-肌动蛋白)形式之间的动态转换调节多种细胞过程，包括细胞分裂、粘附、运动和物质运输；肌动蛋白是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，在肉制品中，肌动蛋白不能单独形成凝胶，但与肌球蛋白以一定比例结合可改变形成凝胶的能力，是影响肉糜及肉制品加工特性的主要特性蛋白。肌动蛋白的变性温度显著高于肌球蛋白，在肉制品冻藏过程中，肌动蛋白比肌球蛋白更稳定。
[0003]目前，国内外对肌动蛋白提取研究主要包括丙酮抽提-层析法、两次层析法及离心直提法，这些方法实验步骤多耗时，操作繁琐溶剂消耗大。双水相萃取技术(Aqueous two-phase system，ATPS)广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域，对蛋白质、酶、病毒、脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸的分离，干扰素、细胞组织、抗生素、多糖、色素和抗体等物质的提取、纯化，具有分相时间短，常温常压下操作条件简便温和，生物活性物质不失活、不变性、不存在有机溶剂残留，易于工艺放大和连续操作，提取效率高等特点。双水相分离体系共分为高聚物/高聚物双水相体系，高聚物/无机盐双水相体系，低分子有机物/无机盐双水相体系，表面活性剂双水相体系四类体系。
[0004]肌动蛋白浓度测定方法主要包括化学法如考马斯亮蓝法、双缩脲法及光谱法等。Spudich等采用Lowry显色法测定兔骨骼肌肌动蛋白浓度(Spudich J A Journal of Biological Chemistry,1971,246,4866-4871)，袁军等应用免疫组织化学染色法结合SDS-PAGE和Western blot法，对凝胶上肌动蛋白条带进行双波长薄层扫描分析，确定各电泳样品中肌动蛋白占总蛋白质的相对百分含量(袁军等细胞与分子免疫学杂志,2002,18(4):363-365)，这些检测方法反应速度慢、易受干扰、定量结果偏差较大，由于缺乏鱼类肌动蛋白标准品，仪器精确定量检测肌动蛋白的研究鲜有报道。因此，建立一种高效、快速制备鱼类肌动蛋白标准品的方法是当前研究的重点方向之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法。
[0006]本专利技术的另一目的还在于提供上述利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现：一种利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，包括如下步骤：
[0008](1)将短链醇、盐和水混合得到双水相体系；
[0009](2)在步骤(1)制备得到的双水相体系中加入鱼肉肌原纤维蛋白或是鱼肉肌原纤维蛋白溶液混匀，得到双水相分离提取体系，其中，双水相分离提取体系中：相比为0.9～1.1，pH值为6～9，短链醇的浓度为质量百分比26～32％，盐的浓度为质量百分比10～14％，鱼肉肌原纤维蛋白的浓度为质量百分比0.1～30％；
[0010](3)当双水相分离提取体系再次出现分层后，取上相，得到鱼类肌动蛋白溶液。
[0011]所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，还包括如下步骤：
[0012](4)将步骤(3)得到的鱼类肌动蛋白溶液浓缩，冻干，得到鱼类肌动蛋白冻干粉。
[0013]所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，还包括如下步骤：
[0014](5)通过毛细管法检测鱼类肌动蛋白冻干粉中肌动蛋白含量。
[0015]所述的双水相体系中的短链醇和盐的浓度是采取浊点法确定得到的。
[0016]所述的短链醇为碳原子个数是C1～C4的醇，包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇；优选为异丙醇。
[0017]所述的短链醇在所述的双水相分离提取体系中的浓度优选为质量百分比28％。
[0018]所述的盐优选为硫酸铵、磷酸氢二钾和碳酸钠中的至少一种；更优选为磷酸氢二钾或硫酸铵。
[0019]所述的盐在所述的双水相分离提取体系中的浓度优选为质量百分比10％。
[0020]所述的pH值优选为8。
[0021]步骤(2)中所述的鱼肉肌原纤维蛋白或是鱼肉肌原纤维蛋白溶液优选通过如下方法制备得到：
[0022](A)取鱼背部肌肉，剁碎，将得到的肉泥和含0.1M NaCl、pH为7.5的Tris-马来酸缓冲液混合，搅拌均匀，离心，取沉淀；
[0023](B)将步骤(A)得到的沉淀和含0.6M NaCl，pH为7.5的Tris-马来酸缓冲液混合，静置，离心，上清液即为鱼肉肌原纤维蛋白溶液；
[0024](C)将鱼肉肌原纤维蛋白溶液浓缩、冻干，得到鱼肉肌原纤维蛋白。
[0025]步骤(A)中所述的Tris-马来酸缓冲液的体积用量(ml)优选为按相当于5倍肉泥质量(g)计算。
[0026]步骤(B)中所述的Tris-马来酸缓冲液的体积用量(ml)优选为按相当于10倍肉泥质量(g)计算。
[0027]步骤(A)和步骤(B)中所述的离心的条件优选为4℃、10000～12000rpm离心5～10min。
[0028]步骤(B)中所述的静置的条件优选为4℃静置1h。
的上相，泳道2为PEG600/K2HPO4的下相、泳道3为PEG2000/K2HPO4的上相，泳道4为PEG2000/K2HPO4的下相、泳道5为PEG4000/K2HPO4的上相，泳道6为PEG4000/K2HPO4的下相，泳道7为PEG6000/K2HPO4的上相，泳道8为PEG6000/K2HPO4的下相，泳道9为PEG10000/K2HPO4体系的上相，泳道10为PEG10000/K2HPO4体系的下相；泳道M为预染蛋白Marker。
[0052]图5为醇/K2HPO4体系提取肌动蛋白SDS-PAGE图；其中，泳道1为甲醇/K2HPO4的上相，泳道2为甲醇/K2HPO4的下相、泳道3为乙醇/K2HP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将短链醇、盐和水混合得到双水相体系；短链醇为碳原子个数是C1～C4的醇；(2)在步骤(1)制备得到的双水相体系中加入鱼肉肌原纤维蛋白或是鱼肉肌原纤维蛋白溶液混匀，得到双水相分离提取体系，其中，双水相分离提取体系中：相比为0.9～1.1，pH值为6～9，短链醇的浓度为质量百分比26～32％，盐的浓度为质量百分比10～14％，鱼肉肌原纤维蛋白的浓度为质量百分比0.1～30％；(3)当双水相分离提取体系再次出现分层后，取上相，得到鱼类肌动蛋白溶液。2.根据权利要求1所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，其特征在于还包括如下步骤：(4)将步骤(3)得到的鱼类肌动蛋白溶液浓缩，冻干，得到鱼类肌动蛋白冻干粉。3.根据权利要求2所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，其特征在于还包括如下步骤：(5)通过毛细管法检测鱼类肌动蛋白冻干粉中肌动蛋白含量。4.根据权利要求1～3任一项所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，其特征在于：所述的短链醇为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇；所述的盐为硫酸铵、磷酸氢二钾和碳酸钠中的至少一种；步骤(2)中所述的鱼肉肌原纤维蛋白或是鱼肉肌原纤维蛋白溶液通过如下方法制备得到：(A)取鱼背部肌肉，剁碎，将得到的肉泥和含0.1M NaCl、pH为7.5的Tris-马来酸缓冲液混合，搅拌均匀，离心，取沉淀；(B)将步骤(A)得到的沉淀和含0.6M NaCl，pH为7.5的Tris-马来酸缓冲液混合，静置，离心，上清液即为鱼肉肌原纤维蛋白溶液；(C)将鱼肉肌原纤维蛋白溶液浓缩、冻干，得到鱼肉肌原纤维蛋白。5.根据权利要求4所述的利用双水相法制备鱼类肌动蛋白的方法，其特征在于：步骤(A)中所述的Tris-马来酸缓冲液的体积用量按...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐明芳，王洋洋，白卫滨，叶蕾，郑春丽，沈林燕，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：