本发明专利技术公开了一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法。该亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，亲和层析柱配基为凝血酶，包括如下步骤：样品前处理，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透析袋袋中进行透析，充分透析后透析袋内的液体为上样液；上样及平衡液冲洗，将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱；冲洗液冲洗，平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗；洗脱液洗脱，冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，并收集洗脱峰；将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。本发明专利技术的方法，能够大批量的纯化凝血酶调节蛋白，收率较高，纯度较高。纯度较高。纯度较高。
【技术实现步骤摘要】
亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法
[0001]本专利技术涉及蛋白提取和纯化领域，尤其是涉及亲和层析柱纯化凝血酶 调节蛋白的方法。
技术介绍
[0002]人尿液凝血酶调节蛋白(Thrombomodulin，简称TM)主要存在于人血 浆和人尿液中，是由557个氨基酸残基构成的糖蛋白，分子量约为60,300Da， 等电点约为3.8，最初由N.L.Esmon等于1981年在实验中发现。
[0003]TM是一种内皮细胞膜糖蛋白，它通过与凝血酶形成复合物来中和凝血 酶活性，并且该复合物有效地激活了C蛋白。以蛋白质S为辅助因子，活 化的C蛋白通过使活化的凝血因子V和VIII失活而充当抗凝剂。人尿TM 在非还原性SDS-PAGE上表现出四种主要形式，在还原状态下SDS-PAGE 上表现出七种主要形式，这些分子大小类似于血浆TM的分子大小。TM通 过切割具有18个氨基酸的信号肽前体产生的一种成熟的跨膜蛋白，完整的 蛋白显示出五个不同的功能域，包括一个N端凝集素样结构域(TM-D1)， 其次是六个表皮生长因子(EGF)样重复序列(TM-D2)，一个丝氨酸/苏 氨酸富集区(TM-D3)，一个跨膜结构域(TM-D4)和一个细胞质结构域 (TM-D5)。
[0004]1993年Susumu Yamamoto纯化出了其中两种较大的分子，非还原性 SDS-PAGE上估计其表观分子量分别为60,000Da(I型)和55,000Da(II 型)，纯化后的I型和II型TM在还原型SDS-PAGE时表现为单链分子。去 糖基化后，两种类型的TM在还原和非还原时均显示出相似的迁移率，表 明迁移的差异是由不同的糖基化引起的。通过氨基酸含量和序列分析，发 现两种类型的尿TM具有相同的氨基酸序列。然而，通过现有的技术手段， 没有办法实现TM的大批量纯化，其表现为收率较低，纯度不高等等。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供亲和层析柱纯化凝血 酶调节蛋白的方法，能够大批量的纯化凝血酶调节蛋白，收率较高，纯度 较高。
[0006]为实现上述目的，本专利技术亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法采用 的技术方案是：
[0007]一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，填料为琼脂糖-凝血酶偶 联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲和色谱柱。
[0008]本专利技术亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法制备方法采用的技术方 案是：
[0009]一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，亲和层析柱配基为凝血 酶，包括如下步骤：
[0010](1)样品前处理
[0011]量取凝血酶调节蛋白粗制品，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透 析袋袋中进行透析，其置换液为亲和层析柱的平衡液，将透析袋放入到置 换液中进行透析，整个透
析过程在4℃下进行，充分透析后透析袋内的液体 为上样液；
[0012](2)上样及平衡液冲洗
[0013]将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱，平衡液为 0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0-0.5mol/L NaCl，pH 为5.0-9.0；
[0014](3)冲洗液冲洗
[0015]平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗，冲洗液冲洗5-10个 亲和层析柱体积，冲洗直至紫外峰将至基线附近，冲洗液选择 0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.1-1.0mol/LNaCl，pH 为5.0-9.0；
[0016](4)洗脱液洗脱
[0017]冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，洗脱液冲洗3-5个 亲和层析柱体积，并收集洗脱峰，洗脱液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl 缓冲体系，所述缓冲液含0.5-3.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；
[0018](5)超滤处理
[0019]将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。凝血酶 调节蛋白上样最大载量为约10mg/mL填料。步骤5超滤采用分子量为 8000-30000Da的超滤膜，所述超滤膜的材质为聚砜。将浓缩后的中间体送 样检测，比活性及纯度得到有效提高。
[0020]凝血酶调节蛋白粗制品液相纯度在4-6％。
[0021]透析袋放入到置换液中进行透析，更换3-4次置换液，最后一次置换 时间为5-8小时，或者过夜，之前的置换时间为0.5-1个小时。
[0022]平衡液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.06mol/L NaCl，pH为7.4。
[0023]冲洗液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.2mol/LNaCl， pH为7.4。
[0024]洗脱液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含2.0mol/LNaCl， pH为7.4。
[0025]步骤2中上样液上样亲和层析柱流速恒定，上样后用3-5倍亲和层析 柱体积的平衡液冲洗。
[0026]使用完的亲和层析柱保存在含20％乙醇的水中。
[0027]凝血酶调节蛋白的溶液和步骤2-4的缓冲液中均加入终浓度为10-20mM 苄脒盐酸盐作为蛋白保护剂。
[0028]亲和层析柱填料的基本骨架为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、合成大分子 或天然高分子聚合物。如Sephadex系列、Sepharose系列、Sephacryl系 列等等。此外，该亲和层析柱结合凝血酶量的不同，会形成不同密度的凝 血酶亲和柱，这些不同密度的亲和柱对凝血酶调节蛋白纯化均有效果。
[0029]亲和层析柱的填料为琼脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联 复合物通过湿法装柱。
[0030]本专利技术与现有技术相比，能够简单方便、成本低、收率高的大规模工 业化生产得到生物活性高、质量稳定的凝血酶调节蛋白中间体，具体优势 如下：
[0031]1、利用层析填料的吸附性，大幅度的提高了TM回收率；
[0032]2、利用填料的专一性，提升了凝血酶调节蛋白的纯度，有效的区分多 种凝血酶调节蛋白变体；
[0033]3、载量高，速度快，有利于工业化放大；
[0034]4、缩短了纯化时间，有效的保护了蛋白的生物活性；
[0035]5、操作简单易行，所需试剂简单易得。
附图说明
[0036]图1为本专利技术实施例1凝血酶调节蛋白粗制品检测图谱。
[0037]图2为本专利技术实施例1凝血酶调节蛋白纯化后液相检测图谱。
[0038]图3为本专利技术实施例2凝血酶调节蛋白纯化后液相检测图谱。
[0039]图4为本专利技术实施例2凝血酶调节蛋白纯化后SDS-PAGE检测图谱。
具体实施方式
[0040]下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施 方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后， 本领域技术人员对本专利技术的各本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，亲和层析柱配基为凝血酶，包括如下步骤：(1)样品前处理量取凝血酶调节蛋白粗制品，将含有凝血酶调节蛋白的溶液放入到透析袋袋中进行透析，其置换液为亲和层析柱的平衡液，将透析袋放入到置换液中进行透析，整个透析过程在4℃下进行，充分透析后透析袋内的液体为上样液；(2)上样及平衡液冲洗将上样液上样亲和层析柱，然后平衡液平衡亲和层析柱，平衡液为0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0-0.5mol/L NaCl，pH为5.0-9.0；(3)冲洗液冲洗平衡液平衡后采用冲洗液对亲和层析柱进行冲洗，冲洗液冲洗5-10个亲和层析柱体积，冲洗直至紫外峰将至基线附近，冲洗液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液含0.1-1.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；(4)洗脱液洗脱冲洗液冲洗后采用洗脱液对亲和层析柱进行洗脱，洗脱液冲洗3-5个亲和层析柱体积，并收集洗脱峰，洗脱液选择0.02-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲体系，所述缓冲液含0.5-3.0mol/LNaCl，pH为5.0-9.0；(5)超滤处理将收集的洗脱峰进行超滤浓缩，得到凝血酶调节蛋白精制品。2.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，凝血酶调节蛋白粗制品液相纯度在4-6％。3.权利要求1所述的亲和层析柱纯化凝血酶调节蛋白的方法，其特征在于，透析袋放入到置换液中进行透析，更换3-4次置换液，最后一次置换时间为5-8小时，或者过夜，之前的置换时间为0.5-1个小时。4.权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：宗扬，侯晓彦，袁玉，傅和亮，沈小宁，李文全，
申请(专利权)人：江苏艾迪药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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