具有集成的基因可编程功能的基于淀粉样蛋白的基础构建材料制造技术

一种材料制造方法，包括：(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)油墨制造结构；和(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定的试剂接触。接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有集成的基因可编程功能的基于淀粉样蛋白的基础构建材料
[0001]简介
[0002]各种行业的研究人员不断寻求新的软材料，包括仿生材料，其提供功能灵活性并且可以使用标准制造技术将其制成有用的结构。在材料科学领域中受到相当多研究关注的一些流行的仿生和生物材料尤其包括肽、脂质、DNA、丝和噬菌体外壳蛋白，其各自都有自身的属性和局限。例如，肽、脂质和DNA可以用于可编程组装，但不适用于基于蛋白结构域的功能的基因工程。供选择地，丝和噬菌体外壳蛋白适合与多种制造技术如光刻、印刷和纺丝一起使用，并且原则上适合于基因工程功能。但是，应用受到了限制，并且由这些材料构建的结构通常无法提供强的长期稳定性，尤其是在苛刻条件下。
[0003]天然生物膜可以高度地抵御苛刻的环境条件，并且细菌生物膜为生物材料的探索提供了丰富的资源。组成这些膜的组分的关键功能属性之一是它们跨多个空间尺度自组装成复杂且有序的分层结构的固有能力。例如，Curli是一类由自组装的CsgA蛋白单体构建的高度聚集的分泌型细胞外细菌淀粉样蛋白纤维，并且参与表面定植和生物膜形成。Curli富含β折叠，非常牢固，可以帮助细菌粘附至各种表面并抵御环境损害。功能性淀粉样蛋白材料相对于噬菌体外壳功能性材料的理论优势在很大程度上源于形成其β折叠的氨基酸的特定化学组成。具体地，最终形成淀粉样蛋白聚合物的单体蛋白大量地富含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酸，这些氨基酸易于形成复杂的氢键网络；已知这些氢网络是淀粉样蛋白生物膜高度抵御苛刻条件的主要来源。在这里，我们利用淀粉样蛋白单体的自组装能力来生成一类新的功能性生物材料，我们将其称为可编程淀粉样蛋白材料(PAM)。
[0004]专利技术概述
[0005]本专利技术提供包含可编程淀粉样蛋白材料(PAM)的组合物，以及相关的制造和使用方法。
[0006]在一个方面，本专利技术提供一种材料制造方法，所述方法包括：(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)油墨制造结构；和(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定(固化)的试剂接触。
[0007]在实施方案中：
[0008]-所述制造步骤包括微转移模塑、压花、旋涂、浸涂、静电纺丝、喷涂、刷涂、光刻、静电纺丝等。
[0009]-所述淀粉样蛋白单体是CsgA、FUS、TDP、TasA等。
[0010]-所述单体例如在(例如，CsgA的)C和/或N末端被一个或多个官能团官能化，所述官能团包括活性酶，异肽标签系统如Spy标签，细胞亲和标签如RGD，或其他功能性肽如抗菌肽，细胞增殖或分化，无机纳米颗粒的模板化生长。
[0011]-所述溶剂是极性溶剂，如HFIP、TFA等，其充当强氢键给体，并且通过氢键破坏来增溶淀粉样蛋白，但是作为弱的氢键受体起作用，并且不与淀粉样蛋白单体形成键，其中所述溶剂可以随时间推移溶解淀粉样蛋白结构并破坏β折叠结构。
[0012]-所述固化剂是醇，如甲醇、乙醇、异丙醇和PEG，H2O(包括缓冲液KPI、PBS、Tris)，
其可以引发内在淀粉样蛋白组装但维持所产生的结构的原始形态。
[0013]-所述接触(固化)步骤包括两步固化：在气相中与第一固化剂的第一接触，以及在液相中与第二固化剂的第二接触，其中所述第一和第二固化剂优选是相同的。对于具有非图案化结构的PAM涂层，在溶液中的一步固化通常就足够；但是，两步固化(蒸气然后溶液)是优选的，特别是对于PAM图案化结构。为了用其他试剂(例如ddH2O、KPI缓冲液或异丙醇)固化图案化结构，两步固化方法也是优选的；但是，与使用甲醇蒸气加上(coupled with)甲醇浸入的固化相比，该固化通常需要更长的时间，因为与甲醇相比，H2O和异丙醇的挥发性较小。
[0014]-所述结构选自：2D和3D阵列以及自支撑图案化多孔PAM片材(PPPS)等，包括不同的表面和界面(2D疏水或亲水表面、3D不规则界面、微流体装置、医学植入物表面等)，均匀的涂层或图案化结构、磁性片材，细胞片材等，并且所述片材可用于多种应用，例如量子点结合以及蛋白缀合和矿化。
[0015]-在所述接触步骤之后，所述结构在固化之后重新获得β折叠，并且在大范围的苛刻条件(高温，例如90℃)和低温(例如-80℃)，有机溶剂，大范围的pH＝2-12的溶液挑战(challenge)后保持超稳定，例如结构和/或功能稳定，并且在环境条件下具有长期稳定性。
[0016]-所述方法还包括用酶，例如用于CsgA和csgA
CBD
的胰蛋白酶或蛋白酶K或用于几丁质的几丁质酶选择性地降解所述结构。
[0017]在各方面，本专利技术提供了通过主题的制造方法制备的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)以及使用该材料和所制造的材料结构的方法。
[0018]本专利技术包括所列举的特定实施方案的所有组合，就如同每个组合已经被详尽地叙述一样。
[0019]专利技术具体实施方案描述
[0020]本文的实施方案和实施例仅以说明的方式而不是限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。
[0021]应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员在其教导下将联想到各种修改或改变，并且所述修改或改变将被包括在本申请的精神和范围和所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0022]用于分子PAM的模块化基因设计我们使用两种不同的收获方法来获得CsgA和功能化(R
1-CsgA-R2)纳米纤维：从培养的生物膜直接收获分泌的纳米纤维，或传统的重组蛋白表达和纯化方法。我们发现结构域结合后，CsgA骨架仍然可以自组装成纳米纤维。
[0023]用于生物制造的PAM油墨(结构恢复确认)在水溶液中纯化后，形成淀粉样蛋白纳米纤维的CsgA蛋白立即开始自组装成纳米纤维结构。然而，我们的新的淀粉样蛋白材料要求我们找到阻止自组装纳米纤维直到CsgA单体原位地在其期望位置的方法。解决该问题的一种见解是，诸如六氟异丙醇(HFIP)的溶剂会破坏聚集的CsgA的二级结构(包括氢键)。因此，可以将收获的聚集的CsgA纳米纤维溶解在HFIP中，以制备可溶性CsgA单体的“油墨”。在尝试使用CsgA进行任何制造之前，我们先表征了这种材料暴露于甲醇之前和之后的形态和结构。来自AFM高度成像、圆二色性分析和ATR-FTIR的结果均表明HIFP暴露不会改变CsgA单体自组装成其典型纳米纤维结构的能力。接下来，我们确认暴露于甲醇确实会引发CsgA单
体复性为CsgA-PAM纳米纤维。通过峰值力定量纳米机械(PFQNM)AFM和纳米压痕测量变性和复性的PAM两者的杨氏模量；复性的PAM几乎是变性的两倍。由于CsgA纳米纤维的分层结构(hierarchical structure)，复性的PAM的杨氏模量与天然牵引丝(0.1～12GPa)相当。
[0024]与多种生物制造工具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种材料制造方法，包括：(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)油墨制造结构；和(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定(固化)的试剂接触。2.权利要求1所述的方法，其中所述制造步骤包括微转移模塑、压花、旋涂、浸涂、静电纺丝、喷涂、刷涂、光刻、静电纺丝等。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述淀粉样蛋白单体是CsgA、FUS、TDP或TasA。4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述单体例如在(例如，CsgA的)C和/或N末端被一个或多个官能团官能化，所述官能团包括活性酶，异肽标签系统如Spy标签，细胞亲和标签如RGD，或其他功能性肽如抗菌肽，细胞增殖或分化，无机纳米颗粒的模板化生长。5.权利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述溶剂是极性溶剂，如HFIP、TFA等，其充当强氢键给体，并且通过氢键破坏来增溶淀粉样蛋白，但是作为弱的氢键受体起作用，并且不与淀粉样蛋白单体形成键，其中所述溶剂可以随时间推移溶解淀粉样蛋白结构并破坏β折叠结构。6.权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述固化剂是醇，如甲醇、乙醇、异丙醇和PEG，H2O(包括缓冲液KPI、PBS、Tris)，其可以引发内在淀粉样蛋白组装...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟超，李颖风，李柯，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：