一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用，本发明专利技术的精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D

【技术实现步骤摘要】
一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。

技术介绍

[0002]生殖细胞经过减数分裂产生单配体的精子和卵子，精子和卵子结合形成受精卵，从而产生新的个体。因此，生殖细胞是种群繁衍的基础，是重要的种质资源。生殖细胞冻存是一种长期有效保存种质资源的方法。鱼类成熟卵子含有大量的卵磷脂和蛋白等物质，导致卵子冻存异常困难；而鱼类精子体积小、数量多、内含物质相对简单，因此鱼类生殖细胞冻存的对象首选精子。精子冻存技术对于克服重要水产养殖育种的时间和地域限制，以及促进品种的改良具有重要意义。
[0003]低温冻存技术目前主要分为梯度降温冻存技术和快速低温冻存技术。其中，梯度降温冻存技术容易产生冰晶，从而对冻存细胞(包括精子)产生损伤。快速冻存技术通过高浓度非渗透生物保护剂让细胞脱水，同时渗透性保护剂进入细胞，然后经液氮快速冻存完成玻璃化，从而保护冻存细胞。由于大部分海水鱼类可耐受较高渗透压，因此，快速冻存技术在海水鱼类精子冻存中有较好的应用前景。目前，该技术已初步应用于冻存少数海水鱼类的精子，如虹鳟和俄罗斯鲟鱼等。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法不具备普适性，不同海水鱼类的冻存方法和冻存效率存在非常明显的差异。
[0004]中华乌塘鳢是一种生活在潮间带的名贵鱼类。其人工繁殖受到以下3个难题的困扰：(1)其精巢易出现发育不良；(2)有近10％的个体形成同时具有精卵巢的败育性腺；(3)成熟雄鱼的精子难以通过人为轻轻挤压而排出。因此，收集和冻存中华乌塘鳢高质量的精子具有非常重要的经济价值。然而，现有的海水鱼类精子冻存方法应用于中华乌塘鳢的精子冻存时，效果较差，不利于中华乌塘鳢的大规模生产和繁殖。
[0005]因此，开发高效的精子低温冻存技术，并将其应用到保存高质量中华乌塘鳢的精子，进行大规模生产和繁殖，对其种质资源的保护和养殖品种的改良均具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提出了一种精子冻存液及其应用，针对中华乌塘鳢精子的特性，本专利技术的精子冻存液中添加了多种生物保护剂，用于中华乌塘鳢精子的冷冻保存，损伤小，复苏后精子活力高，体外受精率高，能够用于人工授精。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)和海藻糖。
[0009]本专利技术根据中华乌塘鳢精子的特性，配制了适合中华乌塘鳢精子活动的稀释液，并且在稀释液中添加了多种抗冻保护剂(DMSO、BSA和海藻糖)制备精子冻存液，将中华乌塘
鳢精子和上述冻存液混合，在精子冻存液的高渗透压下，精子可以快速脱水，并且抗冻试剂能够较好的进入精子细胞中，精子在冻存液的短暂平衡下，经过快速低温冷冻可以有效防止冰晶的形成，从而减少精子的损伤，提高精子的冻存成活率以及体外受精率。
[0010]优选地，上述的精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
[0011](7.10-8.10)g/L氯化钠、(0.30-0.70)g/L磷酸二氢钠、(1.05-1.30)g/L碳酸氢钠、(0.20-0.60)g/L氯化钾、(0.15-0.45)g/L二水氯化钙、(0.50-1.50)g/L D-葡萄糖、(0.15-0.35)g/L七水硫酸镁。
[0012]进一步地，所述精子稀释液包括以下质量浓度的成分：
[0013]7.66g/L氯化钠、0.51g/L磷酸二氢钠、1.16g/L碳酸氢钠、0.38g/L氯化钾、0.31g/L二水氯化钙、1.00g/L D-葡萄糖、0.26g/L七水硫酸镁。
[0014]优选地，所述精子稀释液的pH为6.5-7.5，渗透压为(300-350)mOsmol/kg。进一步地，所述精子稀释液的pH为7.0、渗透压为320mOsmol/kg。
[0015]优选地，所述抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，二甲亚砜(DMSO)的质量百分比浓度为5％-15％，牛血清白蛋白(BSA)的质量百分比浓度为1％-3％，海藻糖的质量浓度为(35.0-45.0)g/L。进一步地，DMSO的质量百分比浓度为10％，BSA的质量百分比浓度为10％，海藻糖的质量浓度为38.7g/L。
[0016]本专利技术还提供了上述的精子冻存液在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种中华乌塘鳢精子的冷冻保存方法，具体包括以下步骤：
[0018]S1、精液采集：在繁殖期，选择精巢发育成熟的健康雄性亲鱼，通过剪碎精巢收集精子；
[0019]S2、精液稀释：采用权利要求1-4任一项所述的精子冻存液对步骤S1中收集得到的精子进行稀释；
[0020]S3、精子冻存：先将步骤S2稀释后的精液置于室温进行避光平衡，然后置于液氮表面上方冷冻停留一段时间，紧接着没入液氮中进行快速冻存处理，最后转移到-150℃低温保存。
[0021]本专利技术的中华乌塘鳢精子冷冻保存方法方便快捷，无须特殊的冻存装备，冻存效率高。精子活性检测和体外授精结果表明，复苏后精子活力高，体外受精率高，冻存3个月的中华乌塘鳢精子存活率为97.27％，冻存18个月的中华乌塘鳢精子存活率为95.74％，体外平均受精率为55.23％。
[0022]优选地，步骤S2所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-4)。进一步地，所述精子与精子冻存液的混合体积比为1:(2-3)。
[0023]优选地，避光平衡后置于液氮表面上方(4-6)cm处停留(10-20)分钟。进一步地，避光平衡后置于液氮表面上方5cm处停留15分钟。
[0024]优选地，所述快速冻存处理的时间为(12-36)小时。进一步地，所述快速冻存处理的时间为24小时。
[0025]优选地，所述避光平衡的时间为8-12分钟。进一步地，所述避光平衡的时间为10分钟。
[0026]优选地，精子冻存后还包括精子复苏方法：即将步骤S3冻存的精子在37℃恒温水浴锅中轻轻摇晃迅速解冻后，于4度避光保存，使精子复苏。
[0027]精子冻存的最终目标是能应用于体外受精，复苏采用本专利技术方法冻存的中华乌塘鳢精子，将其与成熟卵子混合后进行体外受精，通过统计受精后原肠期胚胎的比例，计算得出冻存精子产生的受精卵的比例超过50％，与已报道的海水鱼类(除俄罗斯鲟鱼冻存精子受精率为90％之外)冻存精子的受精率(均不超过50％)相比，本专利技术方法可以大大提高冻存精子的体外受精率，有利于冻存精子的大规模生产和繁殖。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0029]本专利技术提供一种精子冻存液，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精子冻存液，其特征在于，所述精子冻存液包括精子稀释液和抗冻保护剂，所述精子稀释液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖和七水硫酸镁，所述抗冻保护剂包括二甲亚砜、牛血清白蛋白和海藻糖。2.根据权利要求1所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述精子稀释液包括以下质量浓度的成分：(7.10-8.10)g/L氯化钠、(0.30-0.70)g/L磷酸二氢钠、(1.05-1.30)g/L碳酸氢钠、(0.20-0.60)g/L氯化钾、(0.15-0.45)g/L二水氯化钙、(0.50-1.50)g/L D-葡萄糖、(0.15-0.35)g/L七水硫酸镁。3.根据权利要求2所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述精子稀释液的pH为6.5-7.5，渗透压为(300-350)mOsmol/kg。4.根据权利要求1所述的一种精子冻存液，其特征在于，所述抗冻保护剂添加到精子稀释液中时，二甲亚砜的质量百分比浓度为5％-15％，牛血清白蛋白的质量百分比浓度为1％-3％，海藻糖的质量浓度为(35.0-45.0)g/L。5.权利要求1-4任...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，张洪，董梦丹，张弯弯，贾坤同，易梅生，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：