本发明专利技术公开了一种双酶法拆分制备高纯度共轭亚油酸异构体的方法，包括(1)将共轭亚油酸混合异构体、醇与酶液混合进行酯化反应，后分层获得上相产物；(2)上相产物加入碱液、醇和疏水性有机溶剂，分层，上相为富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯的溶剂相，减压旋蒸得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯；取下层溶液调酸性后，加入疏水性有机溶剂和可溶性盐形成三相，上相为富含t10，c12异构体的共轭亚油酸；(3)向步骤(2)的共轭亚油酸酯中加入可溶性盐溶液、脂肪酶及亲水性溶剂，进行酶催化水解反应，之后分层，上相中得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸。本发明专利技术反应条件温和，拆分效率高，可实现盐和酶的再利用。可实现盐和酶的再利用。
【技术实现步骤摘要】
一种双酶法拆分制备高纯度共轭亚油酸异构体的方法
[0001]本专利技术属于生物工程与食品
，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用脂肪酶拆分共轭亚油酸异构体的方法。
技术介绍
[0002]共轭亚油酸是一种具有多种生理活性的功能性脂肪酸，在中国卫生部的第12号公告中被认为是新资源食品。共轭亚油酸具有抗肿瘤，抗动脉粥样硬化，抗高血压，降低脂肪沉积等作用，是一类有助于预防疾病安全降低人身体脂肪的物质，常被用于食品、保健品。
[0003]共轭亚油酸的不同异构体，主要存在形式是c9，t11和t10，c12异构体，具有不同的生理作用，c9，t11异构体具有抗肿瘤、抗癌活性，而t10，c12异构体则在降低机体脂肪积累方面有重要作用。目前的生产共轭亚油酸主要采用化学异构法，得到的是混合异构体，异构体的分离过程较为复杂。为了避免t10，c12异构体的副作用影响，制备高纯度的c9，t11异构体是目前研究的热点。但由于其异构体之间物理及化学性质相似，直接萃取、蒸馏等常规分离方法难以将其分离。采用尿素包合法和低温结晶的方法，能够在一定程度上将其分离，但总体纯度不高，操作却极为复杂，损失巨大。利用具有高选择性的酶将一种异构体酯化或其酯化物水解，而另一种异构体以酸或酯的形式保留，最后再将两种酸分别形成的性质不同的酸和酯分离，近年来受到了广泛重视。多次酶法拆分是有利于获得纯度更高的异构体，例如NAGAO,Toshihiro尝试利用两次酯化，获得了93.1％的纯度的共轭亚油酸。但该分离提纯过程需要多次分子蒸馏，以及酸碱处理萃取等，过程极为复杂，成本极高。更重要的是，该过程需要多次高温加热处理，而共轭亚油酸极易氧化，最终导致更多有害副产物的富集，而且需要消耗大量能量。而且在传统的油水或微水的拆分体系中，酶的催化选择性较低、产物酸和酯的分离需要碱洗、酸洗或高温超低压的分子蒸馏等一系列复杂过程，酸碱耗费严重、环境污染大、酶回用困难等难题让其举步维艰。因此需要开发一种高效、可控的连续催化及分离体系。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是针对目前酶法拆分共轭亚油酸过程中，存在的成本高，反应操作复杂，连续化生产困难，异构体选择性不高等问题，提供了一种高效快速的酶法拆分共轭亚油酸异构体的方法。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0006]一种双酶法拆分共轭亚油酸异构体的方法，包括如下步骤：
[0007](1)将共轭亚油酸混合异构体、短链醇与脂肪酶或磷脂酶的酶液混合搅拌进行酯化反应，合成富含单一异构体的共轭亚油酸酯，离心或静置分层，获得上相产物；
[0008](2)上述上相产物加入含乙醇的碱液和疏水性有机溶剂，离心或静置分层，上层萃取相为富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯的溶剂相，减压旋蒸得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯；取下层溶液加入酸调节溶液至酸性后，再加入疏水性有机溶剂和可溶性盐形
成三相，上相为富含t10，c12异构体的共轭亚油酸；中间相为富乙醇相，下层为富盐相的可溶性盐溶液；
[0009](3)向步骤(2)的共轭亚油酸酯中加入可溶性盐溶液、脂肪酶及亲水性溶剂，搅拌条件下进行酶催化水解反应，反应结束后，离心或静置使其分为三层，上相中得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸。
[0010]本专利技术步骤(2)和(3)中的可溶性盐溶液可循环利用。
[0011]优选地，步骤(1)所述短链醇与共轭亚油酸混合异构体的摩尔比为1:0.5-3；步骤(1)所述短链醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇和正辛醇中的一种或两种以上。
[0012]优选地，步骤(1)酯化反应条件为:反应时间为0.5-48h，反应温度为15-50℃；加酶量为80-200U/g，相对于共轭亚油酸异构体混合物质量。
[0013]优选地，步骤(2)的碱液为浓度0.1-10mol/L的氨水-乙醇溶液、氢氧化钠-乙醇溶液和氢氧化钾-乙醇溶液中的一种或两种以上；其中乙醇的浓度为10-50％。
[0014]优选地，步骤(2)所述疏水性有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯、异辛烷、异丙醚中的一种或两种以上。
[0015]优选地，步骤(2)所述酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸的一种或两种。
[0016]优选地，步骤(2)和(3)所述可溶性盐为硫酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾，碳酸钠、磷酸二氢钾中的一种或两种以上。
[0017]优选地，步骤(3)所述的亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[EMIM]ETSO4、[OMIM]Cl中的一种或两种以上。
[0018]优选地，步骤(1)所述脂肪酶为Lipase AYS，Lipase AY 30，CALB，Novozyme 435，磷脂酶为PLA2，PLC，PLD；步骤(3)所述的脂肪酶为Lipase AYS，Lipase AY 30，CALB，Novozyme 435。
[0019]优选地，所述可溶性盐溶液的浓度为10％～40％。
[0020]优选地，步骤(3)所述的亲水性溶剂、脂肪酶、共轭亚油酸酯与可溶性盐溶液的质量比为0.2-0.8、0.005-0.5、0.05-0.8。
[0021]优选地，步骤(3)所述的体系pH为5-9；反应条件为:时间为0.5-24h，温度25-55℃。
[0022]本专利技术中步骤(1)酯化反应的酶需要适量的水，能提高其反应活性，步骤(2)加入碱液将下相调至pH为8～10的碱性环境，加入酸将下相调至pH为3～5的酸性环境，用疏水性溶剂萃取后分别得到富含c9，t11异构体与富含t10，c12异构体，可用于进一步拆分。
[0023]本专利技术中步骤(2)配制碱液需要加入一定体积分数的乙醇，不加入乙醇影响萃取效率，回收的共轭亚油酸酯产物减少。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0025]本专利技术克服了目前酶法拆分共轭亚油酸异构体过程中，存在的成本高，反应操作复杂，连续化生产困难，反应效率不高等问题，提供了一种高效快速的酶法拆分共轭亚油酸异构体的方法。具体表现在:(1)反应步骤简单，不需要特殊设备和高能耗，即可高纯度的c9，t11共轭亚油酸异构体；(2)利用该多酶反应过程，可将酶、未反应乙醇和部分盐同步回收，有利于酶和产物的纯化和回收，大幅减少环境污染，减少物耗从而降低成本。具有能耗小，原料利用率高，反应效率高等优点，解决了现有的酶法拆分共轭亚油酸异构体存在的难
题，有效得到高纯度的c9，t11异构体，拆分效率最高达到98％以上。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0027]本实施例中所用的Lipase AYS、Lipase AY30(Candida rugosa lipases)购于日本天野公司，共轭亚油本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双酶法拆分制备高纯度共轭亚油酸异构体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将共轭亚油酸混合异构体、短链醇与脂肪酶或磷脂酶的酶液混合搅拌进行酯化反应，合成富含单一异构体的共轭亚油酸酯，离心或静置分层，获得上相产物；(2)上述上相产物加入含乙醇的碱液和疏水性有机溶剂，离心或静置分层，上层萃取相为富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯的溶剂相，减压旋蒸得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸酯；取下层溶液加入酸调节溶液至酸性后，再加入疏水性有机溶剂和可溶性盐形成三相，上相为富含t10，c12异构体的共轭亚油酸；中间相为富乙醇相，下层为富盐相的可溶性盐溶液；(3)向步骤(2)的共轭亚油酸酯中加入可溶性盐溶液、脂肪酶及亲水性溶剂，搅拌条件下进行酶催化水解反应，反应结束后，离心或静置使其分为三层，上相中得到富含c9，t11异构体的共轭亚油酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述短链醇与共轭亚油酸混合异构体的摩尔比为1:0.5-3；步骤(1)所述短链醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、异戊醇和正辛醇中的一种或两种以上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)酯化反应条件为:反应时间为0.5-48h，反应温度为15-50℃；加酶量为80-200U/g，相对于共轭亚油酸异构体混合物质量。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的碱液为浓度0.1-10mol/L的氨水-乙醇溶液、氢氧化钠-乙醇溶液和氢氧化钾-乙醇溶液中的一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：李志刚，方颖琳，杨博，王永华，陈华勇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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