发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，具体涉及发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用，本发明专利技术提供血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中应用，本发明专利技术还提供长链二元酸生产菌株，其具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性。通过导入血红蛋白基因，长链二元酸生产菌株的发酵生产性能显著提高，菌株的发酵液中羟基脂肪酸和脂肪酸等发酵副产物的含量显著下降，极大地提高了长链二元酸的提取纯化效率，降低了生产成本，为制备高纯度的长链二元酸产品及提高下游产品的质量提供了新方法。品及提高下游产品的质量提供了新方法。

【技术实现步骤摘要】
发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵领域，具体涉及发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7。长链二元酸作为单体原料，具有广泛的用途，如用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、润滑剂、塑化剂防腐剂以及香料等。长期以来，长链二元酸通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法自身具有诸多限制，例如得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物，需要复杂的提取纯化步骤、且对环境不友好等。而微生物发酵法生产长链二元酸具有低污染、能够合成化学合成方法难以合成的产物(如12碳以上的长链二元酸)且纯度高等特点，因此，近年来化学合成法生产长链二元酸逐渐被微生物发酵法取代。
[0003]长链二元酸的微生物发酵法生产主要通过烷烃经ω-氧化生成，继而又可以经过β-氧化途径降解。尽管较传统的化学合成法产生的二元酸纯度高，但发酵过程中由于不完全氧化导致产品中残留有羟基脂肪酸、脂肪酸等杂质，这些杂质的存在会严重影响下游产品的质量，如产品的色泽以及其它物理、化学性质等。杂质的存在为长链二元酸的提取纯化带来不小的挑战。因此，降低发酵产生的杂酸的含量成为生物合成法面临的重要问题，在一定程度上影响了生物法生产长链二元酸产业的发展。
[0004]现有技术中关于长链二元酸生产菌株的遗传改造多集中于通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径，提高长链二元酸的产率。如原Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,1991，11(9),4333-4339)研究发现，敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径，从而达到底物100％的转化率，而在此基础上过量表达P450及氧化还原酶CPR-a基因，可以使产量得到有效提升。赖小勤等(中国专利技术专利CN103992959B)的研究表明向二元酸生产菌株中引入CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。清华大学曹竹安等人(Biotechnol.J.,2006，1,68-74)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体的运输过程中的关键基因CAT的一个拷贝，部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，也可以有效降低二元酸的降解，从而使二元酸产量得到显著提高。
[0005]目前，长链二元酸发酵过程中产生的杂酸仍然是长链二元酸生产过程中面临的关键问题，因此，亟需开发能够有效降低杂酸含量的菌株和发酵生产方法。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供发酵生产长链二元酸的菌株及其制备方法与应用。
[0007]长链二元酸发酵过程中杂酸等副产物的产生是影响长链二元酸提取纯化和收率的关键因素，专利技术人长期致力于长链二元酸发酵生产的研究，在发酵实践中发现，在发酵后
期，由于产物积累导致发酵液粘度急剧升高，可能使得发酵菌株面临氧气供应不足的问题，进而导致ω-氧化反应不完全，造成羟基酸和脂肪酸等副产物的积累。专利技术人尝试采用传统的增加溶氧的方式，如增加通气量、用纯氧替代空气、提高搅拌速度或者添加表面活性剂等，但发现这些方式并不能有效解决溶氧的问题，同时还会降低细胞活力而导致菌株的发酵性能受到影响，而且纯氧的使用还会极大地增加生产成本。
[0008]由于长链二元酸合成的代谢途径的特性，氧化过程在长链二元酸的合成中具有高度的复杂性，在菌株细胞内存在复杂的调控网络和机制。长链二元酸的合成过程中，生产菌株对于氧气的摄取、利用以及氧气利用率对于菌株生长、长链二元酸合成相关的ω-氧化、β-氧化和三羧酸循环等途径代谢流量分布等多个代谢模块之间相互作用，相互制约。专利技术人发现，将血红蛋白基因导入长链二元酸的生产菌株中，能够显著提高菌株的底物ω-氧化过程，使得ω-氧化更加完全，进而促进烷烃等底物充分氧化，显著降低了羟基脂肪酸和脂肪酸等副产物的合成。
[0009]首先，本专利技术提供血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中应用。
[0010]具体地，所述应用为将血红蛋白基因导入出发菌株中构建长链二元酸的生产菌株。
[0011]本专利技术中，所述血红蛋白基因来源于微生物、植物或动物。
[0012]优选地，本专利技术所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)、大麦(Hordeum vulgare)、蚕豆(Vicia faba)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)或抹香鲸(Physeter microcephalus)。更优选地，所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)或四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)。
[0013]更优选地，本专利技术所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌的血红蛋白vgb基因或四棱豆的血红蛋白lhb基因，或者是与所述vgb基因或lhb基因编码相同蛋白的基因。
[0014]具体地，所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌(Vitreoscilla)的血红蛋白vgb基因或vgb基因的片段；血红蛋白vgb具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述血红蛋白vgb基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。
[0015]或者，所述血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因(SEQ ID NO.49)或lhb基因的片段。四棱豆的血红蛋白lhb的氨基酸序列见SEQ ID NO.50。
[0016]所述血红蛋白还可以是上述来源的血红蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。
[0017]本专利技术中，将基因导入菌株可以采用常规的基因工程方法，包括但不限于电转化、化学转化等转化方法以及转导、转染、接合等方法。
[0018]本专利技术中，所述出发菌株为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的菌株。
[0019]本专利技术中，所述底物优选为C9～C22的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
[0020]更优选为C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪
酸盐中的一种或多种。
[0021]最优选为C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种。
[0022]本专利技术中，所述长链二元酸为C9～C22的长链二元酸中的一种或多种。
[0023]优选为C9～C18的长链二元酸中的一种或多种。
[0024]更优选为癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血红蛋白基因在发酵生产长链二元酸中应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将所述血红蛋白基因导入出发菌株中构建长链二元酸的生产菌株；优选地，所述血红蛋白基因来源于微生物、植物或动物；优选地，所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)、大麦(Hordeum vulgare)、蚕豆(Vicia faba)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)或抹香鲸(Physeter microcephalus)；更优选地，所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌的血红蛋白vgb基因或四棱豆的血红蛋白lhb基因，或者是与所述vgb基因或lhb基因编码相同蛋白的基因。3.一种长链二元酸生产菌株，其特征在于，所述生产菌株具有与出发菌株相比提高的血红蛋白的活性，所述提高的血红蛋白的活性通过如下方式中的一种或多种实现：(1)增加所述出发菌株中血红蛋白基因或其同源基因的拷贝数；(2)将所述出发菌株中血红蛋白基因或其同源基因的转录或翻译调控元件替换为高活性的调控元件。4.根据权利要求3所述的生产菌株，其特征在于，所述血红蛋白基因来源于微生物、植物或动物；优选地，所述血红蛋白基因来源于透明颤菌(Vitreoscilla)、大麦(Hordeum vulgare)、蚕豆(Vicia faba)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)或抹香鲸(Physeter microcephalus)；更优选地，所述血红蛋白基因是来源于透明颤菌的血红蛋白vgb基因或四棱豆的血红蛋白lhb基因，或者是与所述vgb基因或lhb基因编码相同蛋白的基因。5.根据权利要求3或4所述的生产菌株，其特征在于，所述菌株还具有与出发菌株相比降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性，所述降低的乙酰辅酶A氧化酶的活性通过如下方式中的一种或多种实现：(1)失活所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因；(2)将所述出发菌株中乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因的转录或翻译调控元件替换为低活性的调控元件；(3)采用血红蛋白基因或其同源基因替换所述出发菌株的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因；优选地，将一个拷贝的血红蛋白基因或其同源基因替换所述出发菌株的一个拷贝的乙酰辅酶A氧化酶基因或其同源基因。6.根据权利要求3～5任一项所述的生产菌株，其特征在于，所述出发菌株为能够将包括长链烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种的底物转化为长链二元酸的菌株；所述出发菌株选自细菌、酵母或霉菌；优选为选自棒杆菌属(Corynebacterium)、白地霉菌属(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)的微生物；更优选为假丝酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：CIBT美国公司，
类型：发明
国别省市：