组合物及其应用、细胞培养基及间充质干细胞的复苏方法技术

本发明专利技术涉及一种组合物及其应用、细胞培养基及间充质干细胞的复苏方法。该组合物包括黄体酮、雌二醇、玻连蛋白、胶原蛋白和L

【技术实现步骤摘要】
组合物及其应用、细胞培养基及间充质干细胞的复苏方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，特别是涉及一种组合物及其应用、细胞培养基及间充质干细胞的复苏方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐带血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力和多向分化潜能，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用。MSCs在不同的诱导条件下，可在体外分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等。MSCs连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，是用于研究衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞，也是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，具有广阔的临床应用前景。
[0003]MSCs在人体内含量极少，若要作为药物应用于临床，则必须经过体外大规模的培养扩增，才能获得足够的、能起到治疗效果的细胞量。目前MSCs体外培养，主要使用两种类型的培养体系：一是使用的基础培养基加动物血清(例如，胎牛血清，fetal bovine serum,FBS)的血清培养体系，二是使用基础培养基加血清替代物的无血清培养体系。无血清培养体系的成分明确，是目前MSCs体外培养的主流方向。
[0004]MSCs是粘附生长型细胞，在体外培养时，需要先附着到培养器皿表面扩展成它原来的形态，才能够进入正常的生命代谢过程。细胞粘附并非一种需要能量的过程，而是与细胞表面所带的电荷有关。细胞首先分泌细胞外基质蛋白黏附在培养器皿的底面，细胞通过其表面的蛋白与细胞外基质蛋白结合，完成粘附过程。MSCs在体外培养时，经常需要复苏已经冻存在液氮中的MSCs，而刚复苏的生命活动未被激活，仍处于静息状态，无法通过自身的代谢活动分泌粘附因子来完成附着。
[0005]目前为提高MSCs复苏时的贴壁率，主要采取以下两种方法复苏MSCs：一是在培养器皿表面预先包被一层粘附蛋白，然后用该培养皿复苏MSCs。虽然采用这种方法复苏MSCs时效果好，然而，在培养皿表面预先包被粘附蛋白的操作比较繁琐，对于MSCs体外大规模培养十分不便，不利于MSCs药物工业化及临床应用。二是在培养基里补充粘附蛋白，例如采用传统血清培养体系，虽然传统血清培养体系中的FBS含有多种蛋白能够促进MSCs的粘附，然而由于FBS成分十分复杂，不仅含有适合细胞粘附和生长的因子，同样也含有不利于细胞粘附和生长的因子，因此在复苏MSCs时的提高复苏MSCs粘附的效果不明显，并且由于传统血清培养体系中血清的成分的复杂性，其临床应用也受到了限制。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种组合物，该组合物添加到无血清培养体系中可以提高间充质干细胞复苏时的贴壁率，且该组合物成分明确，安全性高，利于间充质干细胞体外大规模培养和临床应用。
[0007]一种组合物，包括黄体酮、雌二醇、玻连蛋白、胶原蛋白和L-抗坏血酸。
[0008]上述组合物通过黄体酮、雌二醇、玻连蛋白、胶原蛋白和L-抗坏血酸的相互配合，使得使用该间充质干细胞培养基复苏间充质干细胞时，间充质干细胞的贴壁率高，存活率高。且该组合物成分明确，安全性高，利于间充质干细胞体外大规模培养和临床应用。
[0009]在其中一个实施例中，所述组合物为粉剂或溶液剂；及/或，所述雌二醇为β-雌二醇，所述胶原蛋白为Ⅳ型胶原蛋白。
[0010]上述的组合物在细胞培养基中的应用。
[0011]在其中一个实施例中，所述雌二醇为β-雌二醇，所述胶原蛋白为Ⅳ型胶原蛋白，所述组合物的工作浓度在以下范围内：黄体酮1nM～10nM，β-雌二醇0.4nM～4nM，玻连蛋白20μg/L～200μg/L，Ⅳ型胶原蛋白20μg/L～200μg/L，L-抗坏血酸10mg/L～100mg/L；
[0012]优选地，所述组合物的工作浓度在以下范围内：黄体酮的工作浓度为2nM～5nM；β-雌二醇的工作浓度为1nM～2nM；玻连蛋白的工作浓度为50μg/L～100μg/L；Ⅳ型胶原蛋白的工作浓度为50μg/L～100μg/L；L-抗坏血酸的工作浓度为25mg/L～50mg/L；
[0013]优选地，所述组合物在培养细胞时的工作浓度在以下范围内：黄体酮的工作浓度为5nM，β-雌二醇的工作浓度为2nM，玻连蛋白的工作浓度为100μg/L，Ⅳ型胶原蛋白的工作浓度为100μg/L，L-抗坏血酸的工作浓度为50mg/L。
[0014]一种细胞培养基，包括上述的组合物和无血清培养基。
[0015]在其中一个实施例中，所述无血清培养基为无血清间充质干细胞培养基。
[0016]一种间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
[0017]将冻存的间充质干细胞复融后，接种于上述的细胞培养基中。
[0018]在其中一个实施例中，所述接种的密度为0.6
×
104个/cm2～1
×
104个/cm2。
[0019]在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。
[0020]在其中一个实施例中，所述复融在37℃水浴条件下进行。
附图说明
[0021]图1为实施例2中接种4h后的各组培养基对应的间充质干细胞的细胞形态；
[0022]图2为实施例2中接种8h后的各组培养基对应的间充质干细胞的细胞形态；
[0023]图3为实施例2中接种12h后的各组培养基对应的间充质干细胞的细胞形态；
[0024]图4为实施例2中接种4h后的各组培养基对应的间充质干细胞的贴壁率的柱状图；
[0025]图5为实施例2中接种8h后的各组培养基对应的间充质干细胞的贴壁率的柱状图；
[0026]图6为实施例2中接种12h后的各组培养基对应的间充质干细胞的贴壁率的柱状图；
[0027]图7为实施例3的各组培养基对应的间充质干细胞的活率的柱状图；
[0028]图8～图11分别为实施例4中对照组1、对照组3、实验组4和实验组5的间充质干细胞的表面标志物的流式检测结果；
[0029]图12为实施例5中的Oct4、Nanog和Sox2的表达水平结果。
具体实施方式
[0030]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许
多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。
[0031]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0032]本专利技术一实施方式提供一种细胞培养基，该细胞培养基包括组合物和无血清培养基。该细胞培养基能够提高间充质干细胞在复苏时的贴壁率，提高间充质干细胞的存活率，实现间充质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，包括黄体酮、雌二醇、玻连蛋白、胶原蛋白和L-抗坏血酸。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为粉剂或溶液剂；及/或，所述雌二醇为β-雌二醇，所述胶原蛋白为Ⅳ型胶原蛋白。3.权利要求1或2所述的组合物在细胞培养基中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述雌二醇为β-雌二醇，所述胶原蛋白为Ⅳ型胶原蛋白，所述组合物的工作浓度在以下范围内：黄体酮1nM～10nM，β-雌二醇0.4nM～4nM，玻连蛋白20μg/L～200μg/L，Ⅳ型胶原蛋白20μg/L～200μg/L，L-抗坏血酸10mg/L～100mg/L；优选地，所述组合物的工作浓度在以下范围内：黄体酮的工作浓度为2nM～5nM；β-雌二醇的工作浓度为1nM～2nM；玻连蛋白的工作浓度为50μg/L～100μg/L；Ⅳ型胶原蛋白的工作浓度为50μg/L～100μg/L；L-抗坏血酸的工作浓度为25mg/L～50mg/L；优选地，所述组合物在培养细胞时的工作浓度在以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈东煌，陈海佳，戚康艺，姜交华，王小燕，
申请(专利权)人：广东国科细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：