一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控制造技术

本发明专利技术公开了一种医用hUC

【技术实现步骤摘要】
一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控


[0001]本专利技术涉及医用培养
，具体是一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控。

技术介绍

[0002]外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。
[0003]所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
[0004]现有培养技术培养制备效率低，质控把关较差。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，包括HUC-MSCS-MVS原料及质控、HUC-MSCS-MVS制备流程及质控和HUC-MSCS-MVS存储和运输及质控，所述HUC-MSCS-MVS原料及质控步骤为：1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带。
[0007]2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原体检测;3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；所述HUC-MSCS-MVS制备流程及质控步骤为：S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用。
[0008]S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍。每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细
胞，立即放入37℃恒温箱消化3min。3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态。迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min。弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养。
[0009]S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温。待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍。吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS。使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞。4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min。仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀。此为细胞碎片。将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中。将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用。
[0010]S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织。BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、1/2原液10μl、1/4原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μg/μl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，然后在各孔中加入10μl不同浓度的蛋白标准品和待测样本;5、孵育：37℃孵箱孵育45分钟；6、计算蛋白浓度：酶标仪检测各孔在562nm处的OD值，根据标曲线浓度来计算样本浓度。流式细胞术鉴定hMSC-MVs步骤为：（1）从-80度冰箱中取出装有微粒的EP管，置于室温待其完全融化，分别取300ul纳米粒子计数为2
×
1011个的微粒分装到EP管中；（2）标记6管流式管，每管加入50μl细胞悬液；每管中加入Annexin
-Ⅴ-
BV4212ul避光孵育10min。再按以下方案在各流式管中加入流式抗体：第1管：CD90-FITC5μl；第2管：CD105-PerCP-Cy5.55μl；第3管：CD73-APC5μl；第4管：空白对照管5μl；第5管：hMSCPositiveIsotypeControlCocktail120μl及PEhMSCNegativeIsotypeControlCocktail20μl；第6管：hMSCPositiveCocktail20μl及PEhMSCNegativeCocktail20μl。（3）轻柔拍打流式管混匀抗体，室温下避光孵育30min；（4）没管中加入PBS150μl使总体积达200μl；（5）加入10.0μl1.33μm的标准定量微球，上机检测。微生物检测：在自动化过程中，选择样本进行微生物检测筛查，确保产品不含细菌、病毒等有害成分；S5、遵循以下流程：完善母体和胎儿检测—签订自愿捐赠协议—12小时内收集脐带干细胞—对脐带干细胞进行干性、活性、菌体检测—确定安全后采用饥饿方法获得含有MVs的上清—使用梯度离心法获取高含量的MVs—对获得的MVs进行流式、蛋白、粒径、电镜、菌体检测—安全后选用硅化容器保存在-80
°
以下环境3-6月—使用时迅速融化后用PBS重悬—注射前对其进行形态观测—注射后密切观测患者；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控，其特征在于，包括HUC-MSCs-MVs原料及质控、HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控和HUC-MSCs-MVs存储和运输及质控，所述HUC-MSCs-MVs原料及质控步骤为：1.自愿捐赠，以自愿的原则，按照国家伦理委员会相关规定，遵守相关法律的前提下，在捐赠者知情同意的情况下，自愿捐赠脐带；2.产前母体检查，梅毒螺旋体、艾滋病病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原体检测；3.产前母胎儿检查，排除胎儿及胎盘疾病，如：胎儿无先天畸形，无遗传病等；4.脐带细胞排查，对脐带来源的干细胞进行基因验证测序，排除重大疾病因素；检验干细胞活性；检测细胞有核细胞比例；细菌、霉菌、衣原体等培养阴性等；5.备用，完善上述检测后，入库冻存备用；所述HUC-MSCs-MVs制备（流程）及质控步骤为：S1、医院捐赠脐带来源，脐带来源进行上述质控检测合格后，在液氮中冻存备用；S2、将S1步骤中干细胞复苏增殖至80%以上汇合时，进行细胞传代，步骤如下：提前将所需PBS、培养基、胰蛋白酶复温；在超净台中，弃去培养瓶中的细胞上清液，加入5mlPBS，轻轻摇晃，后倒掉，重复3遍；每孔加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰酶充分淹没底部细胞，立即放入37℃恒温箱消化3min；3min后取出培养瓶，于光学显微镜下观察细胞是否变圆浮起，可轻轻震荡培养瓶，使大部分细胞在镜下呈漂浮游动状态；迅速于超净台中加入5ml完全培养基终止消化，并将转移至15ml离心管，用PBS冲洗1次瓶内剩余细胞，一同转入离心管中，800rpm离心5min；弃上清，用6ml培养基重悬，轻轻吹打混匀细胞，向已提前加入8ml培养基的3个新培养瓶中各加入2ml细胞混悬液，轻轻摇晃使细胞分布均匀，于光学显微镜下观察确认后，放入37℃/CO2培养箱中培养；S3、提前将所需PBS、培养基拿出复温；待第5代UC-MSCS增殖至80%以上融合时，弃去细胞上清，加入5mlPBS，冲洗3遍；吸尽瓶中残留的PBS，用不加血清血清培养基，于37℃CO2培养箱中饥饿培养48小时，诱导HMSCS释放MVS；使用梯度离心法提取MVs：hMSCs饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，弃去细胞；4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min；仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀；此为细胞碎片；将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中；将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将多瓶离心管中的沉淀用PBS洗涤并转移到一个离心管中，用PBS将离心管中的液体补至标准线处，电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，用1mlPBS重悬沉淀，即得提取的MVs，将MVs转移至无菌EP管中，BCA蛋白定量后于-80度保存备用；
S4、质控：所述HUC-MSCS培养扩增至第5代后，按照MSC国际标准，检测hUC-MSCs的干性，检测如下：一、贴壁细胞；二、具有关键表面标志分子；三、多系分化能力，可在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和其它结缔组织；BCA蛋白定量鉴定步骤为：1、稀释样品：取30μl待测微粒样本，用超纯水稀释，取原液10μl、1/2原液10μl、1/4原液10μl；2、制备蛋白标准品：分别配制6个浓度的蛋白标准品（0、0.05、0.1、0.25、0.4、1μg/μl）；3、制备BCA工作液：BCA反应液与4%硫酸铜按50:1比例配制成工作液；4、上样：先在96孔板中加入100μlBCA工作液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，魏士雄，黎艳红，陈安平，谢艳，黎苏佳，程瑞娟，吴邱红，赵雪婷，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：